Оценка активности оксидоредуктаз нефтезагрязненного чернозема при мелиорации глауконитом, "Dop-uni" и гуматом калия

Деградация почв юга России приобретает с каждым годом все большие масштабы. На территории Ростовской области не осуществляется добыча нефти, но в области находятся перерабатывающие нефть заводы, через ее территорию осуществляют транспортировку нефти. Зачастую эти пути пролегают через самые плодородные почвы мира – черноземы.

Одним из медиаторов техногенного нарушения биологических свойств почвы при нефтезагряз-нении считают биохимическую активность [1]. Окислительно-восстановительные процессы в нефтезагрязненных почвах существенно изменяются и отражаются в изменении активности ферментов класса оксидоредуктаз [2-7]. Для оценки направленности процесса гумусообразования используют показатель степени минерализации чернозема, определяемый по отношению полифенолоксидазы к пероксидазе. При этом исходят из представления, что полифенолоксидаза играет ведущую роль в процессах новообразования гумуса, а пероксидаза – в его минерализации. Пероксидазы почв выполняют окисление органических веществ почв за счет

кислорода воздуха и перекиси водорода. Действие фермента приводит к окислению гумусовых веществ, которые сродни нефти являются углеводородами [8-10]. Полифенолоксидазы - это ферменты, участвующие в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумусового вещества [8, 9].

Снижение содержания нефти в черноземах может быть инициировано применением различных мелиорантов. Среди существующих методов мелиорации нефтезагрязненных почв не показан однозначный способ разложения нефти при надлежащей черноземам биологической активности почв, прямо связанной с плодородием почв. В связи с этим актуально исследование активности оксидоредуктаз нефтезагрязненных почв после внесения мелиорантов различной природы.

Цель работы: оценить изменение активности оксидоредуктаз нефтезагрязненного чернозема при мелиорации глауконитом, «Dop-Uni» и гуматом калия.

Материалы и методики исследования. Объект исследования - чернозем обыкновенный карбонатный южно-европейской фации [11]. Место отбора – Ботанический сад Южного федерального университета (Апах, 0-20). Содержание общего гумуса – 1,3%, реакция почвенной среды (рН) – 7,4. На юге России чаще встречается загрязнение легкой нефтью (плотность 0,818 г/м3). Нефть, вносимая в почву, обладает со следующими характеристиками: массовая доля серы – 0,43%, массовая доля механических примесей – 0,0028%, массовая доля воды – 0,03%, концентрации хлористых солей – 40,1 мг/дм3. После внесения в воздушно-сухую почву нефти (5% от массы почвы), в почву вносили мелиоранты. Для изучения процессов ремедиации нефтезагрязненной почвы были выбраны 3 мелиоранта различной природы: глауконит – минеральный (глинистый) адсорбент; «Dop-Uni» - бактериальный препарат, содержащий три штамма нефтеразрушающих бактерий родов Rhodococcus, Pseudomonas и Candida) и гумат калия – соль гуминовой кислоты. Контролем служили образцы почвы, не подвергавшиеся загрязнению нефтью и воздействию мелиорантов. Эксперимент ставили в 3-х кратной повторности. Все мелиоранты вносили в почву предварительно смешанную с нефтью в дозах рекомендованных производителями. Глауконит добавляли в соотношении относительно нефти 1:6 (0,8% от массы почвы). Биологический препарат «Dop-Uni» добавляли в почву в концентрации 5 л/м2. Гумат калия вносили, исходя из рекомендаций для садовых культур 0,5% раствор. Схема опыта представлена в табл. 1.

Таблица 1. Варианты опыта, используемые в работе

Активность оксидоредуктаз определяли в воздушно-сухих образцах стандартными в экологии и биологии почв методами [12-14]. Активность каталазы (Н 2 О 2 :Н 2 О 2 — оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6.) определяли газометрическим методом по разложению перекиси водорода при контакте с почвой по А.Ш. Галстяну (1956). Активность пероксидаз (донор : Н 2 О 2 – оксидоредуктаза. КФ 1.11.1.7) и полифено-локсидаз (О-дифенол : кислород - оксидоредуктаза. КФ 1.10.3.1) определяли по Л.А. Карягиной, Н.А. Михайловой (1986) окислением гидрохинона до хинонов, имеющих коричневато-бурую окраску при экстрагировании спиртом. О степени минерализации почвы судили по отношению между активностью пероксидаз (ПО) и полифенолоксидаз (ПФО), участвующих в процессах окисления продуктов гидролиза органических соединений с образованием пред-гумусовых веществ. Отношение активностей этих ферментов представляет собой коэффициент гумификации (гумусирования) - К г . По коэффициенту гумификации оценивают процессы минерализации или гумификации, происходящие в почве. Лабораторно-аналитические исследования выполнены в 9-кратной повторности. При обсуждении результатов учитывали статистически достоверные различия при р<0,05. Статистическую обработку данных проводили при использовании программы Statisitica 10.0.

Результаты и их обсуждение.

Изменение активности каталазы. При рекультивации нефтезагрязненных почв именно активность каталазы считают наиболее информативной при оценке состояния экосистемы [3, 4]. Активность каталазы нефтезагрязненного чернозема была на 26% ниже контроля (табл. 2). Активность каталазы в нефтезагрязненном черноземе (5% от массы почвы) составила 5,4 мл О2/г/мин, что согласуется с результатами А.В. Шамраева и О.Н. Гончаровой (2011) [4].При внесении глауконита, гумата калия и «Dop-Uni» активность каталазы слабо изменялась по сравнению с контролем. В то время как при комплексном внесении глауконита с «Dop-Uni» и глауконита с гуматом калия показано увеличение активности каталазы на 17 и 14%. Применение глауконита, гумата калия и комплекса гумата калия + «Dop-Uni» вызвало снижение активности каталазы на 17, 16 и 18% по сравнению с контролем соответственно. Для комплекса глауконит+гумат калия и глауконит+«Dop-Uni» отмечен практически одинаковый стимулирующий эффект – активность фермента выше контроля на 18 и 17% соответственно.

По мнению Т.С. Шориной (2009) [15] процессы окисления нефтезагрязненного чернозема в верхнем слое почвы, через месяц после внесения нефти, связаны с повышенной микробиологической активностью, простимулированной внесением мелиорантов. Похожие результаты были ранее получены при исследовании активности каталазы в нефтезагрязненных почвах юга России [16, 17]. Применение мелиорантов при нефтезагрязнении носило разнонаправленный характер. В вариантах с внесением «Dop-Uni» и глауконит+гумат калия в нефтезагрязненный чернозем наблюдали выраженное подавление активности фермента на 43-60%. Во всех остальных вариантах наблюдали положительный мелиоративный эффект, где активность фермента повышалась по сравнению с нефтезагрязне-нием и достоверно не отличалась от контроля (Н+гумат калия; Н+глауконит; Н+глауконит+«Dop-Uni»; Н+«Dop-Uni»+гумат калия).

Изменение активности пероксидаз и полифе-нолоксидаз. Изменение активности пероксидазы и полифенолоксидазы носило противоположный характер (табл. 2). Загрязнение нефтью достоверно не изменяло активность пероксидазы. Самостоятельное применение мелиорантов в подавляющем большинстве вариантов стимулировало активность пероксидазы на 10-12%. Как известно, пероксидазы катализируют окисление полифенолов в присутствии перекиси водорода или органических перекисей, так как сами перекиси обладают сравнительно слабым окисляющим действием на фенолы. Ее влияние направлено на окисление гумусовых веществ [14]. Некоторые авторы [14] считают, что увеличение активности пероксидаз может быть следствием включения этого фермента в процессы детоксикации загрязняющих веществ.

Активность полифенолоксидаз нефтезагрязненного чернозема до внесения повышалась на 10%. В отдельных случаях (Н+глауконит; Н+«Dop-Uni»+гумат калия) наблюдали снижение активности полифенолоксидазы на 19 и 22% соответственно. В целом по сравнению с незагрязненными образцами активность полифенолоксидаз увеличивалась на

15-20%. Полифенолоксидазы участвуют в превращении органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Похожие тенденции, заключающиеся в стимулировании активности по-лифенолоксидаз внесением нефти, наблюдали в работах Р.Р. Сулейманова с соавторами (2007, 2012) [3, 4]. Авторами было установлено, что активность полифенолоксидаз и эмиссии углекислого газа увеличивалась, что может быть вызвано использованием невысоких доз нефти, как дополнительного источника углерода. При увеличении концентрации нефти выше 5% активность ферментов снижалась [4].

Коэффициент гумификации . Активность по-лифенолоксидаз идентифицирует процессы гумификации чернозема (синтеза гумусовых веществ), пероксидаз – минерализации (распада гумусовых веществ). В таблице 2 представлены абсолютные значения активности каталазы, пероксидаз и поли-фенолоксидаз и показан коэффициент гумификации.

Таблица 2. Изменение активности оксидоредуктаз (М±m) и коэффициента гумификации при внесении мелиорантов в нефтезагрязненный чернозем

Примечание: * достоверные отличия, р<0,05

Коэффициент гумификации или гумусообра-зования (Кг) демонстрирует отношение между активностью полифенолоксидазы и пероксидазы, позволяющий оценить тенденции процессов гумусо-образования: минерализации или гумификации. Если значение коэффициента (Кг) равно 1, то можно утверждать, что процессы синтеза и распада гумусовых веществ находятся в относительном равновесии [18, 19]. Так, в нефтезагрязненном черноземе показан баланс между процессами гумификации и минерализации (Кг=1). Внесение нефти по сравнению с контролем усиливает гумификацию чернозема. В контроле показано увеличение процессов минерализации, т.е. распада гумусовых веществ (Кг=0,90). При самостоятельном внесении мелиорантов, кроме гу-мата калия, показана разная интенсивность процессов минерализации и гумификации. Так, для гумата калия показана тенденция к минерализации (Кг=0,89). При внесении гумата калия с другими мелиорантами Кг = 0,65 для комплекса гумата калия с глауконитом и 0,77 для комплекса гумата калия с «Dop-Uni».

Увеличение коэффициента гумификации не всегда можно идентифицировать как усиление процессов гумусообразования в сторону новообразования. Также нельзя утверждать, что К г меньше 1 свидетельствует об усилении процессов минерализации [4]. При ремедиации загрязненных техническим маслом почв и использовании для биоремедиации бактерий рода Acinetobacter в показано увеличение коэффициента гумификации через 15 суток после начала опыта [20].

Выводы:

• 1.    При нефтезгрязнении чернозема показано снижение активности каталазы на 14%. Активность полифенолоксидазы увеличивалась на 10%. Активность пероксидазы достоверно не отличалась от контроля.

• 2.    После внесения только мелиорантов в чернозем активность каталазы была простимулирована комплексом глауконита с «Dop-Uni» и глауконита с гуматом калия.

• 3.    После внесения мелиорантов в нефтезагряз-неный чернозем показаны как стимулирующие, так и ингибирующие активность эффекты: стимуляция активности каталазы и пероксидаз при внесении гумата калия и комплекса «Dop-Uni»+гумат калия на 15 и 13%. Ингибирование активности каталазы и полифенолоксидаз показана вывлена для глауконита с гуматом калия.

• 4.    Сбалансированные процессы гумификации и минерализации отмечены при внесении глауконита и «Dop-Uni» в нефтезагрязненный чернозем. Тенденции к минерализации (Кг) показаны при внесении гумата калия, глауконита с гуматом калия, «Dop-Uni»с гуматом калия. Гумификация нефтезагрязненных черноземов выявлена при внесении глауконита, «Dop-Uni», комплекса «Dop-Uni» с глауконитом.

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (5.5735.2017/8.9) и Президента Российской Федерации (НШ-9072.2016.11, МК-326.2017.11)

Авторы благодарны ООО «Лаборатория микробных технологий» г. Москва за предоставление бактериального препарата «Dop-Uni» и фирму ООО «Глауконит» г. Челябинск за предоставление глауконита.