Оценка биосовместимости поликапролактоновых матриц, минерализованных ватеритом, при субкутанных имплантационных тестах у белых крыс

¹ Введение. В настоящее время одним из важнейших направлений тканевой инженерии является создание трехмерных скаффолдов, применяемых для стимуляции процессов регенерации. Скаффолды — трехмерные пористые структуры, выполняющие при имплантации в зону дефекта функцию внеклеточного каркаса, по периферии и в толще которого происходит регенерация за счет заселения матрицы клеточными элементами [1]. Для изготовления скаффолдов применяется обширный спектр материалов, имеющих как природное, так и искусственное происхождение [2]. Чтобы обеспечить возможность химической модификации и высокой многофункциональности, предпочтение при разработке скаффолдов отдается искусственным материалам, одним из которых является поликапролактон (ПКЛ) [3]. Данный полимер способен к биодеградации в условиях in vivo с образованием продуктов, не оказывающих токсического воздействия на окружающие участки тканей и на весь организм в целом [4].

Для улучшения остеоиндуктивных и остеокон-дуктивных свойств матриц в их состав включают неорганические вещества, стимулирующие данные процессы. Ватерит (СаСО3) является одним из таких соединений, он способен активировать размножение клеток костной ткани и при переходе в кальцит участвовать в адресной доставке веществ, высвобождая в области дефекта предварительно адсорбированные биологически активные молекулы [5, 6].

К основным требованиям, предъявляемым к скаффолдам, относится биосовместимость. Матрицы должны обладать возможностью васкуляризации, способностью к заселению клеточными элементами, не приводить к негативным изменениям в организме. Имплантационные тестирования, в том числе субку-танные, являются одним из важных и обязательных этапов оценки биосовместимости скаффолда [7].

Цель: оценка биосовместимости матриц, изготовленных из поликапролактона и минерализованных

ватеритом, путем изучения локальных и системных проявлений воспалительной реакции при субкутан-ных имплантационных тестах у белых крыс.

Материал и методы. Эксперимент выполнен на 40 белых нелинейных крысах-самцах массой 200– 250 г, которые были разделены на четыре равные группы: контрольная группа, состоящая из 10 интактных крыс; группа сравнения, включающая 10 ложноо-перированных животных, которым выполнялось полное по объему оперативное вмешательство, но без имплантации матриц; группа отрицательного контроля, состоящая из 10 животных, которым имплантировались матрицы на основе ПКЛ с адсорбированным чужеродным белком, не обладающие биосовместимостью; опытная группа из 10 крыс, которым субку-танно имплантировались ПКЛ/СаСО₃-скаффолды.

Экспериментальная работа проводилась в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в экспериментах и для других научных целей (принятой Советом Европы в 1986 г.), Хельсинкской декларацией по вопросам медицинской этики и Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных (1989), приказом МЗ РФ от 19 июня 2003 г. №267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование осуществлялось в соответствии с рекомендациями Этического комитета Саратовского государственного медицинского университета им. В. И. Разумовского (протокол №6 от 6.02.2018). При выполнении всех манипуляций с животными для достижения наркоза внутримышечно вводилась комбинация телазола (ZoetisInc, США) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина (Interchemie, Нидерланды) в дозе 1 мг/кг.

Для имплантации использовали матрицы на основе ПКЛ, изготовленные методом электроформования в Образовательно-научном институте наноструктур и биосистем СГУ. Животным группы отрицательного контроля имплантировали неминерализованные матрицы с адсорбированным чужеродным белком (нативный овальбумин) на поверхности. Для имплантации животным опытной группы использовались скаффолды, минерализованные ватеритом по мето- дике, описанной Савельевой М. С., Ивановым А. Н., Куртуковой М. О. с соавт. [5].

Для имплантации матриц проводился разрез предварительно депилированной и обработанной антисептиком кожи межлопаточной области крыс. Далее в ране под кожей с использованием браншей пинцета формировался карман 15х15 мм, в который помещался скаффолд в форме диска диаметром 10 мм. После размещения скаффолдов в подкожном кармане рана ушивалась наглухо с использованием нерассасывающейся монофиламентной нити Resorpen 3–0 USP (RESORBA MedicalGmbH, Германия) и обрабатывалась 70%-ным спиртом.

На 21-е сутки после имплантации матриц или ее имитации у ложнооперированных животных под наркозом проводился забор крови путем пункции правых отделов сердца. Кровь забирали в объеме 5 мл в пробирки Vacuettе с активатором свертывания и разделительным гелем. Сыворотку крови получали путем центрифугирования 3000 об/мин. Аликвоты сыворотки крови замораживали и хранили при температуре -200С. Концентрацию ФНО и ИЛ-1 определяли в сыворотке крови экспериментальных животных методом ИФА с использованием наборов реактивов «IL-1β rat» и «TNF-α rat» фирмы eBioscience (BenderMedSystems, Австрия) на микропланшентном спектрофотометре Anthos-2020 (Biochrom, Великобритания).

После забора крови животные выводились из эксперимента путем передозировки препаратов наркоза. Для гистологического исследования скаф-фолд с окружающими тканями извлекали единым блоком. Материал для исследования фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина (ООО «Биовитрум», Россия), обезвоживали в спиртах, после чего заливали в парафин. Срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином Майера (ООО «Биовитрум», Россия) и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Для покрытия срезов применяли среду Bio-Monht (BioOptica, Италия).

Препараты исследовали при помощи микроскопа AxioImager Z2 (CarlZeiss, Германия) и микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «Ломо Фотоника», Россия). На гистологических препаратах выявляли локальные признаки воспалительной ре- акции: отек, гиперемию, инфильтрацию скаффолда и окружающих его тканей иммунокомпетентными клетками. Проводили морфометрический подсчет количества клеток каждой клеточной популяции: фибробластов, фиброцитов, нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, плазмоцитов и макрофагов в пяти полях зрения скаффолда и его перифокальной зоны при увеличении объектива 63х.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 10.0. Проверяли гипотезы о виде распределений вариационных рядов (критерий Шапиро — Уилка). Большинство наших данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовался U-критерий Манна — Уитни, на основании которого рассчитывали Z-критерий и показатель достоверности различия p. Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты. В ходе морфологического исследования препаратов в области имитации имплантации матриц в группе сравнения на 21-е сутки эксперимента локальных признаков воспаления, включая отек, полнокровие сосудов и лейкоцитарную инфильтрацию, не выявлено. В соединительной ткани области имплантации преобладали клетки фибробластического ряда. Так, доля фибробластов составила 54% от общего количества клеток. Фиброцитов обнаружено 32%. Обнаруживались также единичные лейкоциты, преимущественно лимфоциты и макрофаги (табл. 1). Концентрации провоспалительных цитокинов в группе ложнооперированных животных на 21-е сутки эксперимента не имели статистически значимых отличий от уровня ФНО и ИЛ-1 у интактных крыс (табл. 3).

На 21-е сутки после имплантации матрицы с чужеродным белком у животных группы отрицательного контроля вокруг скаффолда обнаруживался соединительнотканный барьер, инфильтрированный лейкоцитами, отек тканей перифокальной области, а также полнокровие сосудов артериального и венозного русла в этой зоне. При морфометрическом анализе установлено, что в перифокальной области скаффолда, не обладающего биосовместимостью, количество фибробластов превышало таковое в препаратах группы ложнооперированных животных

Таблица 1

Клеточные популяции перифокальной зоны ПКЛ/СаСО3-скафолдов и матриц с адсорбированным чужеродным белком в сравнении с соединительной тканью зоны имитации имплантации ложнооперированных животных

Среднее число клеток в пяти полях зрения	Группа сравнения (n=10)	Отрицательный контроль (n=10)	Опытная группа (n=10)
Фибробласты	15 (10; 18)	30 (15; 34) р1<0,05	13 (10; 15) р >0,05 р12<0,05
Фиброциты	9 (5; 12)	9 (6; 13) р1>0,05	11 (7; 16) р >0,05 р12>0,05
Полиморфоядерные лейкоциты	0 (0; 0)	3 (2; 5) р1<0,001	0 (0; 0) р >0,05 р21<0,001
Лимфоциты	2 (0; 3)	7 (3; 11) р1<0,05	0 (0; 1) р >0,05 р21<0,001
Макрофаги	2 (2; 5)	6 (4; 7) р1<0,05	1 (1; 2) р >0,05 р 1<0,001

П р и м еч а н и е : в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; р1, р2 — по сравнению с ложнооперированными и с отрицательным контролем соответственно.

Таблица 2

Клеточные популяции ПКЛ/СаСО3-скафолдов и матриц с адсорбированным чужеродным белком в сравнении с соединительной тканью зоны имитации имплантации ложнооперированных животных

Среднее число клеток в пяти полях зрения	Группа сравнения (n=10)	Отрицательный контроль (n=10)	Опытная группа (n=10)
Фибробласты	15 (10; 18)	5 (1; 12) р1<0,001	38 (21; 47) р <0,001 р12<0,001
Фиброциты	9 (5; 12)	2 (0; 6) р1<0,001	22 (13; 32) р <0,001 р12<0,001
Полиморфоядерные лейкоциты	0 (0;0)	13 (5;16) р1<0,001	0 (0;1) р >0,05 р21<0,001
Лимфоциты	2 (0; 3)	3 (2; 3) р1>0,05	2 (0; 4) р >0,05 р12>0,05
Макрофаги	2 (2; 5)	4 (2; 6) р1>0,05	2 (0; 4) р >0,05 р1<0,05

П р и м еч а н и е : в каждом случае приведены медиана, верхний и нижний квартили; р1, р2 — по сравнению с ложнооперированными и с отрицательным контролем соответственно.

Таблица 3

Концентрация провоспалительных цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных

Группы	ФНО, пг/мл	Ил-1, пг/мл
Контроль (n=8)	9,5 (5,6; 11,6)	16,1 (13,9; 16,6)
Группа сравнения (n=6)	7,2 (6,8; 8,4) p1>0,05	14,9 (14,2; 15,6) p1>0,05
Отрицательный контроль (n=9)	15,7 (12,4; 16,5) p <0,05 p12<0,05	27,5 (23,6; 31,5) p <0,001 p12<0,05
Опытная группа (n=7)	7,6 (3,5; 8,4) p >0,05 p1>0,05 p2<0,05	16,6 (12,2; 18,1) p >0,05 p1>0,05 p2<0,05

П р и м еч а н и е : ФНО — фактор некроза опухоли альфа; ИЛ-1 — интерлейкин-1бета; в каждом случае приведены медиана, нижний и верхний квартили. р1 — по сравнению с животными группы контроля; р2 — по сравнению с ложнооперированными животными; р3 — по сравнению с животными группы отрицательного контроля.

в 2 раза. При этом количество фиброцитов в препаратах этих групп не имело статистически значимых различий (см. табл. 1). В составе лейкоцитарной инфильтрации перифокальной области скаффолдов у животных группы отрицательного контроля преобладающими клеточными типами являлись лимфоциты и макрофаги, количество которых составляло в среднем 13 и 11% клеток соответственно. Кроме того, в составе клеточных популяций перифокальной области скаффолда у животных данной группы обнаруживались полиморфоядерные лейкоциты, преимущественно нейтрофилы, количество которых статистически значимо выше, чем у ложнооперированных животных (см. табл. 1).

У животных группы отрицательного контроля наблюдали слабое заселение матрицы элементами фибробластического ряда, признаков ее васкуляризации не выявлено. Количество фибробластов и фиброцитов в матрице, не обладающей биосовместимостью, статистически значимо меньше, чем в соединительной ткани зоны имитации имплантации группы ложнооперированных крыс в 3 и 4,5 раза соответственно (табл. 2). В ПКЛ-скаффолде с адсорбированным чужеродным белком наблюдали преобладание полиморфных лейкоцитов, которые составили около 48% от общего числа клеток (см. табл. 2). Определялись лимфоциты и макрофаги, число которых достигало в среднем 11 и 15% (см. табл. 2).

У животных группы отрицательного контроля на 21-е сутки эксперимента обнаруживали статистически значимое повышение концентрации ФНО по сравнению с контролем в 1,7 раза, а по сравнению с лож-нооперированными крысами в 2 раза (см. табл. 3). Выявлено также увеличение концентрации ИЛ-1 в 1,7 и 1,9 раза по сравнению с контролем и группой ложнооперированных животных соответственно (см. табл. 3).

На 21-е сутки эксперимента у животных опытной группы в перифокальной зоне ПКЛ/СаСО3-скаффол-да отмечали умеренное кровенаполнение сосудов микроциркуляторного русла. Отеков, лейкоцитарной инфильтрации признаков формирования отграничивающего барьера вокруг ПКЛ/СаСО3-скаффолда у животных данной группы не выявлено. Преобладающим клеточным типом перифокальной области являлись фибробластические элементы. Так, при морфометрии установлено, что количество фибробластов и фиброцитов достигало 52 и 44% от общего числа клеток (см. табл. 1). При этом количество фибробластов в перифокальной области у животных данной группы было в 2,3 раза меньше, чем вокруг матриц, не обладающих биосовместимостью, у крыс группы отрицательного контроля (см. табл. 1). Количество лейкоцитов, макрофагов и нейтрофилов в перифокальной области ПКЛ/СаСО3-скаффолда не имело статистически значимых различий в сравнении с клеточным составом тканей области имитации имплантации у ложнооперированных животных и было статистически значимо ниже по сравнению с перифокальной областью матриц, не обладающих биосовместимостью, у крыс группы отрицательного контроля (см. табл. 1).

На 21-е сутки после имплантации ПКЛ/Са-СО3-скаффолд заселялся фибробластическими элементами и васкуляризировался. Количество фибробластов и фиброцитов в ПКЛ/СаСО3-скаффол-де было в 2,5 раза больше, чем в матрицах, не обладающих биосовместимостью (см. табл. 2). Доля этих клеточных популяций составила 34 и 60% от общего числа клеток соответственно. В структуре ПКЛ/СаСО3-скаффолд обнаруживались единичные лейкоциты, количество которых не имело значимых различий при сравнении с клеточным составом соединительной ткани области имитации имплантации у ложнооперированных животных (см. табл. 2). Количество лейкоцитов в ПКЛ/СаСО3-скаффолдах было в 1,5–2 раза ниже, чем в скаффолдах, не обладающих биосовместимостью, у крыс группы отрицательного контроля (см. табл. 2).

Концентрации ФНО и ИЛ-1 в крови у животных опытной группы не отличались от таковых у крыс групп сравнения и контроля. Концентрации ФНО и ИЛ-1 в сыворотке крови крыс на 21-е сутки после имплантации ПКЛ/СаСО3-скаффолдов были в 2,1 и 1,7 раза меньше, чем у животных группы отрицательного контроля (см. табл. 3).

Обсуждение. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что у ложнооперированных животных на 21-е сутки эксперимента отсутствуют как локальные признаки воспаления в зоне имитации имплантации матриц, так и системные проявления воспалительного ответа. Следовательно, к 21-м суткам эксперимента воспалительные изменения, индуцируемые травмой тканей при оперативном вмешательстве, нивелируются полностью.

У животных группы отрицательного контроля, в отличие от крыс группы сравнения, напротив, отмечаются выраженные воспалительные изменения в зоне имплантации матрицы с чужеродным белком. В ранее опубликованных работах было продемонстрировано, что при подкожной имплантации матриц с адсорбированным чужеродным белком локальные воспалительные сосудистые изменения стойкие и регистрируются в период с 7-х по 21-е сутки эксперимента [7–9]. При этом скаффолд, лишенный биосовместимости, не заселяется соединительнотканными элементами и не васкуляризуется, что также согласуется с ранее опубликованными данными [10]. Полученные данные свидетельствуют, что у животных группы отрицательного контроля отмечается выраженный подъем концентрации в крови провос-палительных цитокинов: ФНО и ИЛ-1, отражающий системные проявления воспалительного ответа. Повышенный уровень ФНО и ИЛ-1 у крыс при подкожной имплантации небиосовместимых скаффолдов объясняет механизм сосудистых изменений, описанный ранее. Следовательно, при подкожной имплантации скаффолдов, не обладающих биосовместимостью, у белых крыс возникает выраженная воспалительная реакция, которая на 21-е сутки характеризуется типичными локальными и системными проявлениями.

Полученные результаты свидетельствуют, что при субкутанной имплантации ПКЛ/СаСО3-скаффолдов у белых крыс опытной группы, в отличие от группы отрицательного контроля, не отмечается локальных признаков воспаления в перифокальной области. Состав клеточных популяций перифокальной зоны ПКЛ/СаСО3-скаффолдов не имеет значимых отличий от соединительной ткани зоны имитации имплантации у крыс группы сравнения. Концентрация цитокинов в крови у крыс на 21-е сутки после имплантации ПКЛ/СаСО3-скаффолдов не отличается от интактных животных, что подтверждает отсутствие проявлений воспаления. При этом на 21-е сутки эксперимента наблюдается активное заселение ПКЛ/СаСО3-скаф-фолдов элементами соединительной ткани и его васкуляризация, что в совокупности с отсутствием воспалительных изменений перифокальной зоны свидетельствует о биосовместимости данного типа матриц.

В настоящее время наиболее перспективной концепцией разработки композитных скаффолдов для стимуляции регенерации костной ткани является сочетание в структуре таких матриц синтетических полимеров, в частности ПКЛ, и минеральных соединений [11–14]. Результаты ряда зарубежных исследований свидетельствуют о высокой степени биосовместимости матриц из ПКЛ, содержащих фосфатные соединения кальция как основы минеральной составляющей для костной ткани [11, 12, 14]. Так, продемонстрирована биосовместимость ПКЛ-скаффолдов, минерализованых гидроксиапатитом [14], бета-трифосфатом кальция [11, 12], а также двухфазным фосфатом кальция, представляющим собой смесь первых двух соединений [13]. Ранее проведенные собственные исследования согласуются с данными зарубежных авторов и подтверждают биосовместимость неминерализованных матриц из ПКЛ и минерализованных гидроксиапатитом [10].

Ватерит представляет собой наименее стабильную форму карбоната кальция [15]. In vitro продемонстрировано, что наночастицы из ватерита в гидрогелевых матрицах не обладают цитотоксичностью и при воздействии межклеточной жидкости или фосфатного буфера переходят в гидроксиапатит [15]. Вместе с тем в базе данных PubMed на сегодняшний день имеются только две работы [5, 16], посвященные матрицам из ПКЛ, минерализованным ватеритом. В частности, установлено, что ПКЛ/Са-СО3-скафолды имеют механические параметры, соответствующие губчатой кости человека, а также показана способность остеобластов к адгезии на этих матрицах в условиях in vitro [16]. Полученные при выполнении настоящей работы данные, касающиеся состава клеточных популяций матриц и отсутствия системных проявлений при их имплантации, подтверждают ранее опубликованные данные [5, 9] и позволяют сделать заключение, что ПКЛ/СаСО3-ска-фолды по критериям биосовместимости не уступают аналогичным скаффолдам из поликапролактона.

Заключение. Отсутствие биосовместимости скаффолда проявляется воспалением в области его имплантации, что сопровождается характерным изменением состава клеточных популяций соединительной ткани перифокальной области. При этом клеточные популяции скаффолдов представлены в основном лейкоцитами, среди которых преобладают нейтрофилы. Локальные тканевые реакции ассоци- ированы с системными проявлениями воспалительного ответа, характеризующегося повышением концентрации провоспалительных цитокинов: ФНО и ИЛ-1. При имплантации ПКЛ/СаСО3-скафолдов как локальных, так и системных признаков воспаления в окружающих скаффолд тканях не отмечается. Состав же клеточных популяций скаффолдов характеризуется преобладанием клеток фибробластического ряда. Совокупность данных биохимических и морфометрических исследований позволяет констатировать высокую степень биосовместимости ПКЛ/ СаСО3-скаффолдов и экспериментально обосновывает возможность их использования для тканевой инженерии.