Оценка цитотоксичности и накопления в опухоли золотосодержащих соединений на основе гиалуроновой кислоты

Одним из приёмов повышения эффективности лучевой терапии злокачественных новообразований является использование бинарных методов лучевого воздействия [1-3], к которым относится фотон-захватная терапия (ФЗТ) [4, 5]. За счёт введения в опухоль специальных препаратов, содержащих металлы с порядковым номером (Z) по таблице Менделеева ≥53 (I, Gd, Au, Pt и др.), увеличивается локальное энерговыделение, обусловленное электронами фотопоглощения и сопутствующего Оже-каскада на атомах этих элементов. Селективное накопление металла в опухолевой ткани и его взаимодействие с рентгеновским излучением сопровождается выбросом вторичного ионизирующего излучения с коротким пробегом частиц и способствует прецизионной эскалации поглощённой дозы, создающей тумороцидный эффект.

Корякин С.Н.* – вед. научн. сотр., к.б.н.; Ульяненко С.Е. – зав. отделом, д.б.н.; Исаева Е.В. – ст. научн. сотр., к.б.н.; Бекетов Е.Е. – ст. научн. сотр., к.б.н.; Ядровская В.А. – вед. научн. сотр., к.х.н.; Успенский С.А. – вед. научн. сотр., к.х.н.; Селянин М.А. – ген. дир.

Метод ФЗТ может быть реализован на типовых медицинских рентгеновских аппаратах (напряжение на трубке ~150 кВ при токе электронов 1-2 мА), обеспечивающих поток фотонов, необходимый для создания канцероцидности, усиливающейся за счёт фотоэффекта.

Основные требования к противоопухолевым препаратам для ФЗТ учитывают такие характеристики как концентрация элемента (как утверждается в некоторых работах [6, 7] не менее 10 мг на 1 г ткани), выраженная туморотропность и отсутствие или низкая цитотоксичность. Кроме того, большое значение имеет вязкость препарата, величина которой должна быть сопоставима с вязкостью крови здорового человека (~3-5 мПа*с), а также технологичность препаративной формы. Потенциальный интерес представляют препараты на основе элементов с большим Z и полисахаридов, в частности комплексы золота (Au) и гиалуроновой кислоты (ГК) [8, 9], что обусловлено высокой биосовместимостью и ускоренной биодеградацией компонентов, исключающих существенное токсическое действие на организм. При этом по энергии ионизации K -оболочки в результате фотоэффекта в технологии ФЗТ золото занимает промежуточное положение – 80,7 кэВ (для Yb – 61,3 кэВ, At – 95,7 кэВ).

В целом бинарная ФЗТ не требует специальной защиты и может осуществляться в обычных поликлинических условиях, что обеспечивает её привлекательность. Однако массовое внедрение метода в онкологическую практику лимитируется, прежде всего, отсутствием препаратов, в полной мере отвечающих требованиям ФЗТ.

Цель исследования – изучить in vivo динамику накопления в опухоли золотосодержащих соединений на основе гиалуроновой кислоты с различным содержанием золота и в различной препаративной форме, а также определение их цитотоксичности в опытах in vitro .

Материалы и методы

В экспериментах in vivo использовали мышей-самцов линии F1 (CBAxC57Bl/6) с массой тела 20-22 г. Суспензию клеток мышиной меланомы В-16 (0,2 мл суспензии, ~ 10⁶ клеток) вводили животным подкожно в бедро правой задней лапки. Исследования проводили через 12 суток после перевивки, при этом объём опухоли составлял 0,8-1,2 см³.

В качестве перспективного соединения для ФЗТ в первой серии опытов in vivo был выбран водорастворимый биоактивный нанокомпозит на основе химически модифицированной соединениями из ряда меланинов соли гиалуроновой кислоты и наночастиц золота. Способ получения биоактивных нанокомпозитов заключается в восстановлении золота из его соли в вязком растворе гиалуроновой кислоты меланином при кипячении и последующей стадией лиофилизации. Метод синтеза представленных для исследования Международным научноисследовательским центром инновационных технологий «МАРТИНЕКС» (Россия, Москва) двух водорастворимых коллоидных комплексов – классический растворный; содержание золота ~ 15-20 мг в 1 мл (или 1,5-2% раствор Au). Содержание меланина в изучаемых соединениях варьировалось от 40 мг в комплексе I до 80 мг в комплексе II. Введение меланина позволяет восстановить и стабилизировать золото путём образования между функциональными группами меланина с золотом координационной связи – хелатов или слабых комплексов [10]. Можно предположить, что для комплекса I свободных, не связанных с золотом, групп на меланине практически нет. Для комплекса II свободных групп на меланине должно остаться ~ 50%, в то же время именно они могут обеспечивать транспорт связанных и свободных частиц золота. При этом с большой степенью вероятности можно допустить, что всё золото связано с меланином, но не всё с гиалуроновой кислотой.

Для уточнения содержания золота в комплексах I и II их водные растворы анализировали с использованием оптического эмиссионного метода с индуктивно связанной плазмой в качестве атомизатора на приборе ICP-OES (Varian, Австралия) и сравнивали со стандартным раствором золотохлористоводородной кислоты с известным содержанием золота. В результате проведённых исследований установлены значения концентрации золота: в комплексе I – 15,0±0,2 мг в 1 мл, в комплексе II – 22,0±0,3 мг в 1 мл. Концентрация золота после озоления проб биологического материала с добавлением 0,1 мл каждого из комплексов показала практически те же значения: 14,0±0,2 и 21,0±0,3 мг в 1 мл соответственно для комплексов I и II.

Золотосодержащие соединения вводили в опухоль через 12 суток после перевивки (I и II группы животных, по 6 животных на каждую точку исследования) однократно снизу ложа опухоли в центр в объёме 0,1 мл. Содержание золота на момент введения в расчёте на всю опухоль у животных I группы составило 1,5 мг (1500 мкг) на опухоль, II – 2,2 мг (2200 мкг) на опухоль.

Через 0,5, 1 и 3 ч после введения соединений животных под наркозом декапитировали и отбирали опухоль для последующего анализа на содержание золота.

Пробоподготовку проводили на основе общепринятых подходов в собственной модификации [11].

Содержание золота в образцах опухоли также определяли с использованием оптического эмиссионного метода на приборе ICP-OES.

Во второй серии опытов in vitro для определения цитотоксичности использовали сухой комплекс (К III) – нанокомпозит с содержанием золота 2,5±0,3 мг. Эта препаративная форма более технологична с точки зрения приготовления водных растворов с заданной концентрацией и их введения в опухоль. В день эксперимента навеску порошка массой 40 мг взвешивали на лабораторных электронных весах Adventurer (RV) (Ohaus, Швейцария) и растворяли в 2 мл стерильной подготовленной воды (квалификация «для культур клеток»). Содержание золота в растворе 5 мг/мл. Часть раствора использовали в неразбавленном виде, а из другой части готовили двукратные разведения с концентрацией золота 2500, 1250, 625 и 312,5 мкг/мл раствора.

Цитотоксичность золотосодержащего соединения оценивали по торможению пролиферации клеток мышиной меланомы В-16, которую культивировали в монослое по стандартной методике. За сутки до эксперимента клетки высевали в чашки Петри (Corning) диаметром 35 мм по 200 тысяч клеток на чашку в 2 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и помещали в СО 2 -инкубатор (SANYO MCO-15AC) (5% СО 2 , +37 ^оС). Через 24 ч инкубации, когда клетки находились в начале фазы экспоненциального роста, в чашки добавляли по 0,5 мл водных растворов комплекса III с разным содержанием золота так, чтобы конечная концентрация элемента в чашке составляла 62,5, 125, 250, 500 и 1000 мкг на 1 мл питательной среды (соответствующие варианты опыта). В этой среде клетки инкубировали в течение 24 ч, после чего среду удаляли, монослой дважды отмывали от комплекса фосфатнобуферным солевым раствором (рН 7,2-7,4), добавляли новую питательную среду с сывороткой, но без комплекса III, и инкубировали еще 24 ч. Затем клетки снимали с пластика смесью 0,25% трипсина – 0,02% версена (соотношение 1:1), собирали в 1 мл фосфатного буфера и подсчитывали их количество в этом объёме в камере Горяева. Количество клеток, выросших в среде, содержащей золото, в каждом варианте опыта сравнивали с контролем (инкубация клеток в тех же условиях, но без добавления золотосодержащего комплекса III). Общее время инкубации клеток от посева до снятия составило 72 ч.

Статистические методы анализа учитывали несмещённую оценку среднего значения ( X ) и стандартного отклонения среднего значения ( S x ) [12]. Ошибку среднего количества клеток по нескольким чашкам рассчитывали по формуле:

х =л I s 2. + s 2 .

X X₁ X_n

При расчёте ошибки значений активности пролиферации относительно контроля использовали аналогичную формулу:

^Xx = ^ Xx

Преп.

+ SX

.

Контр.

Результаты и обсуждение

Динамика содержания золота в опухоли мышей в первой серии опытов в течение 3 ч после введения соединения свидетельствует о различной скорости выведения металла в зависимости от первоначальной его концентрации (рис. 1). Кривые выведения Au в пределах исследованных сроков описываются логарифмической зависимостью как в случае расчётов на всю опухоль (рис. 1А), так и при нормировании содержания золота на 1 г опухоли (рис. 1Б).

Содержание золота в случае комплекса I в расчёте на всю опухоль варьировалось в пределах от 175 до 250 мкг (рис. 1Б). Различия на каждый срок исследования были несущественны, т.е. в течение 3 ч после введения золотосодержащего соединения в опухоль содержание элемента в новообразовании сохранялось на уровне 11,7-16,7% от введённого количества, что свидетельствует о наличии слабовыраженных туморотропных свойствах нанокомплекса.

Рис . 1. Динамика накопления (выведения) золота в опухоли после однократного внутриопухолевого введения комплексов I и II: А – в расчёте на 1 г опухолевой ткани, Б – в расчёте на всю опухоль. Уравнения рис. А: 165,1-79,64*ln(x), 199,0-20,94*x; уравнения рис. Б: 195,1-91,42*ln(x), 255,2-27,06*x.

Несмотря на иную закономерность накопления золота в опухоли при введении соединения с большим содержанием элемента (комплекс II, 2200 мкг на всю опухоль), через 0,5 ч после введения содержание этого элемента в опухоли составило 385 мкг (17,5%), т.е. независимо от концентрации золота во введённом соединении (в диапазоне концентраций 1500 и 2200 мкг на опухоль), накопление элемента в опухоли составляло около 17%. Однако, если через 3 ч после введения нанобиокомпозита в опухоль кратность снижения содержание золота при введении комплекса I составила 1,4 раза, то при введении комплекса II – 3,4 раза.

Данные по соотношению концентрации золота в опухоли при введении комплексов I и II (I/II) и соотношению абсолютных значений содержания этого элемента представлены на рис. 2. Значения этих показателей во все сроки наблюдения (0,5; 1 и 3 ч после введения) были практи- чески идентичными, а кривая описывалась логарифмическим уравнением.

Рис. 2. Отношение выведения золота из опухоли (в расчёте на 1 г опухолевой ткани и на весь опухолевый объём) при введении комплексов I и II. Уравнение: 1,15+0,64*ln(x).

Пунктирной линией отмечено начальное различие в концентрации золота в комплексах I и II (1500 и 2200 мкг на опухоль соответственно) – 0,68 ед.

Несмотря на более низкую концентрацию золота в опухоли через 0,5 ч после введения комплекса I (различия между нормированными на 1 г ткани данными в первой и второй группах значимы при p≤0,5 и составили 70%), в этой группе животных наблюдалась высокая удержи-ваемость золота в опухоли в течение трёх часов наблюдения. Скорость биологической деградации комплекса II оказалась существенно выше, чем комплекса I, и через 3 ч после введения отношение концентрации золота в опухоли животных первой и второй групп составило 1,7 раза.

Учитывая, что условия проведения опыта были одинаковыми (близкий объём опухоли, одинаковая техника приготовления растворов соединений и их введения в опухоль), можно предположить, что в комплексе I золото практически всё было связано с меланином и гиалуроновой кислотой, а в комплексе II часть меланина могла находиться в свободном состоянии и при введении в опухоль обеспечивать первичное большее продвижение нанокомплексов и столь же быстрое их выведение. В пользу этого предположения свидетельствуют и данные накопления золота в опухоли через 1 и 3 ч после введения: независимо от первоначальной концентрации золота при введении в опухоль (1500 и 2200 мкг) значимых различий содержания металла в опухоли у животных I и II групп не наблюдалось. Таким образом, можно предположить, что в 1,5% коллоидном растворе золота содержание меланина 40 мг/мл может быть достаточным или даже избыточным для связывания металла в слабые комплексы.

При меньшем (40 мг/мл) содержании меланина в коллоидном растворе золотосодержащего соединения обеспечивается лучшее удержание Au в опухоли и отмечается более высокий градиент накопления элемента в системе опухоли/кровь и опухоль/кожа через 1 ч после введения [11]. Повышенное содержание золота в первые полчаса после внутриопухолевого введения комплекса (независимо от его концентрации) дает основание считать этот период наиболее благоприятным для реализации фотон-захватной терапии.

Вместе с тем отмечается неравномерность распределения Au по объёму опухоли при однократном введении золотосодержащих соединений [11], что может быть обусловлено как характеристиками самого комплекса (коллоидный раствор), так и тем, что клетки меланомы В-16 формируют под кожей in vivo у мышей опухолевые узлы, отличающиеся подавленной неоваскуляризацией [13]. В свою очередь, градиент концентрации золота в различных сегментах опухоли способен отрицательно сказаться на эффективном создании равномерно поглощённой дозы при проведении фотон-захватной терапии.

В опытах in vitro с использованием комплекса III торможение деления клеток меланомы В-16 зависело от содержания золота в питательной среде (рис. 3). Выраженная цитотоксичность наблюдалась для концентрации элемента в среде культивирования 1000 мкг/мл: в этом варианте опыта клетки не только не пролиферировали, но большей частью погибли. При концентрации золота 250 мкг/мл питательной среды пролиферация клеток меланомы В-16 снизилась на 50% относительно контроля. Минимальное торможение пролиферации клеток (85,4% от контроля) отмечено при их культивировании в среде, содержащей 62,5 мкг золота на 1 мл.

Рис. 3. Пролиферация клеток меланомы B-16 в зависимости от концентрации золота в питательной среде

Численные значения количества клеток меланомы В-16, выросших через 72 ч культивирования, приведены в таблице.

Таблица

Количество клеток меланомы B-16 после инкубации с раствором золотосодержащего комплекса

Содержание золота, мкг/мл среды	Количество клеток на чашку, тыс.	Количество делений клеток 1
Контроль (0)	2728±226	3,8±0,4
62,5	2331±161	3,5±0,3
125	2043±139	3,4±0,3
250	1363±95	2,8±0,2
500	523±47	-
1000	7±3	-

1 Рассчитано для контрольной и опытных групп, в которых пролиферация клеток относительно контроля составляла не менее 50%.

Подсчёт клеток в контрольной группе показал, что без добавления раствора золотосодержащего комплекса III в питательную среду в стандартных условиях культивирования в течение 72 ч каждая клетка могла претерпеть ~ 4 деления, в результате чего количество клеток в чашке возросло более чем в 13 раз (с 200 тыс. до ~ 3 млн). Оценить численно пролиферацию клеток, как и выяснить, являются ли оставшиеся клетки частью первоначальной популяции или вновь образованными, в варианте с максимальной концентрацией золота (1000 мкг/мл среды) не представляется возможным, так как большая часть клеток погибла и была смыта при отмывании монослоя от комплекса. Численность клеток в других вариантах опыта возросла от 2,6 до 12 раз пропорционально содержанию золота в среде культивирования. Для концентраций 62,5 и 125 мкг/мл среды их количество мало отличается от численности в контрольной группе.

Таким образом, при концентрациях золота в среде культивирования клеток меланомы В-16 250 и 500 мкг/мл проявлялись цитостатические свойства комплекса III, тогда как при концентрации 1000 мкг/мл – уже цитотоксические. Это необходимо принимать во внимание при определении дозы введения золотосодержащего нанокомпозита в опухоль, поскольку как цитостатик он может иметь побочные эффекты, характерные для этого класса соединений. Известно, что цитостатики, являясь веществами с высокой биологической активностью, не обладают избирательным действием на опухоль. Это приводит к тому, что при их применении страдают многие нормальные органы и ткани, в первую очередь те, для которых характерен высокий пул быстро обновляющихся клеток (костный мозг, слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта, волосяные фолликулы и др.) [14]. Так как развитие цитостатических эффектов может существенно меняться в зависимости от пролиферативной активности клеток, это также может иметь значение при разработке и скрининге препаратов, отвечающих требованиям фотон-захватной терапии.

Заключение

Одной из задач современной радиобиологии является поиск способов повышения эффективности лучевого и комбинированного лечения злокачественных новообразований для максимального поражения опухоли при минимальном повреждении нормальных тканей. Перспективным направлением в решении проблемы избирательного поражения опухолей является развитие метода фотон-захватной терапии. Замедленное внедрение этого сегмента лучевой терапии в клиническую практику во многом связано с несовершенством предлагаемых препаратов для ФЗТ: неравномерностью их распределения в опухоли и невозможностью достижения нужной концентрации для реализации фотоэффекта.

Результаты проведённого исследования in vivo и in vitro с введением золотосодержащих соединений различных препаративных форм с разным содержанием золота в опухоль или культивирование клеток меланомы В-16 в питательной среде с указанными соединениями свидетельствуют о перспективности использования соединений Au на основе гиалуроновой кислоты и меланина в целях ФЗТ. Вместе с тем полученные данные служат основанием для планирования экспериментальных работ по скринингу препаратов, их апробации в реализации фо-тон-захватных эффектов, а также разработки схем применения ФЗТ в зависимости от локализации опухоли и пролиферативной активности её клеток.

Исследования проведены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Калужской области (проект № 14-44-03084).