Оценка фармакокинетических свойств изоборнилфенолов in silico

Introduction. The potential of a new compound in the ongoing drugs discovery process is initially explored using virtual instruments, where its activity is predicted based on its molecular structure.

Aim. This study aimed to evaluate the pharmacokinetic parameters and possible toxicity of isobornyl compounds based on virtual tools.

Material and Methods. Several free Internet resources were used to assess the absorption, distribution, metabolism, excretion (ADME), and toxicity (T) of 2,6-diisobornyl-4-methylphenol (1, Dibornol), 2-hydroxy-3-isobornyl-5-methylbenzaldehyde (2), and 2-((di-n-butylamino) methyl)-6-isobornyl-4-methylphenol (3). Pharmacokinetic properties were calculated on ADMETlab platform. Toxicity and physical properties were evaluated using TEST software based on the structure-property quantification models of organic substances according to structure–property principle. Web server ProTox_II was used for acute toxicity assessment.

Results. Plasma protein binding degrees were 76,9% for (1), 85,9% for (2), and 91,8% for (3). All three compounds were capable of penetrating the blood-brain barrier. Dibornol was identified neither as a substrate nor as an inhibitor of P-glycoprotein unlike (2) and (3). The half-life of all compounds was short (about 2 hours); the clearance was slow (about 2 mL/min*kg). The study showed that (2) and (3) potentially exert the toxic effects during the developmental stage of the organism, while ADMETlab showed potential cardio- and hepatotoxicity for (2) and (3), respectively. All compounds had extremely low solubility in water, which affected the assessments of other indicators by TEST software. The ProTox_II server showed the extremely low toxicity LD50 for all compounds (toxicity class 5).

Актуальность

Антиоксиданты – это группа перспективных лекарственных веществ, обладающих многими цитопротек-тивными эффектами, в частности, нейропротективным. Их применение в терапии нарушений мозгового кровообращения широко обсуждается с тех пор, как появились доказательства наличия окислительного стресса при ишемии мозга [1]. При снижении мозгового кровотока нарушаются процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях, прекращается перенос кислорода до ци-тохромоксидазы, что стимулирует образование свободных радикалов (СР) [2]. Образование СР – это значимый компонент развития эндотелиальной дисфункции и эндогенной интоксикации [3].

Имеются доказательства того, что высокое содержание антиоксидантов в плазме крови свидетельствует о низком риске церебрального инсульта, однако исследования дополнительного приема антиоксидантов не показали обнадеживающих результатов [1]. Тем не менее клинические рекомендации терапии острого нарушения мозгового кровообращения предполагают необходимость восстановления кровотока в зоне ишемии, нейропротекцию [4].

Пространственно-затрудненные (экранированные) фенолы обеспечивают торможение процессов радикального окисления, а эффективность этого торможения и активность действия соединения, в конечном итоге, определяются природой заместителя в орто- и пара-положениях [5]. Изоборнилфенолы в реакциях инициированного окисления этилбензола показывают высокую константу скорости взаимодействия с пероксильными радикалами [6]. Биологическая активность этих веществ опосредована их способностью встраиваться в мембраны и участвовать в регуляции процессов окислительной деградации липидов под действием СР [7].

Лекарственные субстанции, демонстрирующие эффективность in vitro , могут быть неэффективны in vivo благодаря физико-химическим особенностям и низкой биодоступности [8].

В текущем процессе создания лекарственных препаратов потенциал нового соединения часто первоначально изучается с помощью виртуальных инструментов. Возможность соединения проявлять полезную терапевтическую активность (иногда называемую Druglikeness) предсказывается из его молекулярной структуры [9]. Прогнозирование биодоступности и обусловливающих ее свойств, таких как растворимость и липофильность, является важным до момента начала синтеза потенциального кандидата. Это может быть лучшим способом избежать возможных экологических проблем, истощения затрат реагентов и времени [10].

Сервисы и программы для прогностического моделирования физико-химических свойств, токсичности и фармакологических эффектов построены на моделях QSAR/QSPR (количественное соотношение «структура – биологическая активность/структура – свойство») [10]. В настоящий момент представлено более 200 инструментов для оценки различных сторон фармакокинетических свойств соединений . Согласно анализу публикаций в PubMed, для виртуального скрининга и лучшего прогноза потенциала веществ используют сразу несколько программ, поскольку каждый сервис построен на своей математической модели и предикторах [11]. Для оценки возможных взаимодействий и фармакологических эффектов хорошо себя зарекомендовали PASS online (Институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, Россия) и SwissTargetPrediction (Swiss Institute of Bioinformatics, Швейцария). Многопрофильная платформа ChemAxon представляет портфель многофункциональных продуктов с 2010 г., но требуется покупка лицензии. Сервис ADMETSAR (East China University of Science and Technology, Китай), разработанный в 2012 г. и глобально обновленный в 2018 г., предлагает комплексный анализ фармакокинетики. OPERA 2.0 осуществляет прогнозирование физико-химических свойств и конечных точек экологической токсичности, TEST. 3.0 (United States Environmental Protection Agency, США) – прогнозирование экологической токсичности, применяется с 2013 г. SwissADME (Swiss Institute of Bioinformatics, Швейцария) – молодая платформа. Несмотря на то, что первые упоминания встречаются с 2017 г., в настоящий момент платформа достаточно популярна, предлагает много методов и оценок, предпочтительна для малых молекул. ADMETlab (Central South University, Китай) – относительно новая платформа (применяется с 2018 г.) с хорошими перспективами, предлагает расширенный анализ химических соединений.

Изоборнильные соединения (рис. 1) синтезированы и подробно описаны авторским коллективом под руковод- ством профессора А.В. Кучина: 2-гидроксиметил-4-ме-тил-6-изоборнилфенол является промежуточным продуктом синтеза азотсодержащих изоборнилфенолов [12, 13].

2,6-диизоборнил-4-метилфенол (1, Диборнол®) активно изучается и прошел доклинические исследования на моделях ишемии/реперфузии головного мозга [14].

Рис. 1. Структуры 2,6-диизоборнил-4-метилфенол (1), 2-гидрокси-3-изоборнил-5-метилбензальдегид (2), 2-((ди-н-бутиламино)метил)-6-изоборнил-4-метилфенола (3)

Fig. 1. The structures of 2,6-diisobornyl-4-methylphenol (1), 2-hy-droxy-3-isobornyl-5-methylbenzaldehyde (2), and 2-((di-n-butylamino) methyl)-6-isobornyl-4-methylphenol (3)

Цель данного исследования: оценка фармакокинетических особенностей и возможной токсичности изобор-нильных соединений с помощью виртуальных инструментов.

Материал и методы

В работе использовано несколько свободных Интер-нет-ресурсов. Платформа ADMETlab предоставляет свободно доступный веб-интерфейс для систематической оценки фармакокинетических свойств химических соединений; состоит из четырех основных модулей: «Анализ сходства с лекарствами», «Прогноз фармакокинетики», «Систематическая оценка» и «Поиск сходства». В ходе исследования оценивали ряд количественных и качественных показателей. Оценка основных физико-химических свойств включала: растворимость в воде (LogS), липофильность (LogD7,4) – распределение между водной фазой (фосфатный буфер при pH7,4) и несмешиваю-щимся с водой органическим растворителем (обычно октанолом), коэффициент распределения липофильности (LogP) при равновесных концентрациях. Способность к абсорбции в кишечнике определяли по прогнозируемой кишечной проницаемости (PAPP) на модели клеток линии Caco-2. Качественно оценивали способность соединений быть ингибитором (Pgp-Inhibitor) или субстратом (Pgp-Substrate) гликопротеина-Р, кишечной абсорбции человека (HIA). На модели классификации, основанной на физико-химических дескрипторах, рассчитывали биодоступность, превышающую 30%, при пероральном приеме (F30%). Распределение производных изоборнилфенолов оценивали по трем параметрам: связывание с белками плазмы (PPB, %), объем распределения (VD) и по категориальному показателю возможности проникновения через гематоэнцефалический барьер (BBB permeability). Метаболизм определяли по возможности взаимодействия с пятью цитохромами – CYP1A2, CYP3A4,

CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6. Для оценки элиминации рассчитывали клиренс и период полувыведения. Оценку токсичности проводили по 6 качественным показателям и расчету дозы острой токсичности при применении внутрь (LD50). Кардиотоксичность в ADMETlab определялась по вероятности блокады гена hERG, что может приводить к аритмии и удлинению интервала QT, гепатотоксичность (H-HT) – по токсичности реактивных метаболитов, мутагенность – по тесту Эймса (AMES). ADMETlab позволяет оценить вероятность иммунных реакций, приводящих к сенсибилизации кожи (SkinSen), медикаментозному поражению печени (DILI) и рассчитать максимальную рекомендуемую суточную дозу для человека (FDAMDD). FDAMDD – это предполагаемый верхний предел дозы, при превышении которого эффективность препарата не увеличивается, и/или нежелательные побочные эффекты начинают перевешивать положительные [15].

Программа TEST оценивает значения экологической токсичности и физические свойства органических соединений на основе молекулярной структуры химического вещества с использованием методологий количественных соотношений «структура – активность» (QSAR). QSAR – это математические модели, используемые для прогнозирования показателей токсичности на основе физических характеристик структуры химических веществ (молекулярные дескрипторы) [16].

ProTox_II – веб-сервер оценки острой пероральной токсичности на крысах. Формат представления молекул для всех использованных ресурсов – SMILE или графическое представление с использованием Marvin JS.

Результаты и обсуждение

Веб-сервер ADMETlab определяет степень сходства изучаемого соединения с известными лекарственными средствами. Программа опирается на эмпирические правила, помогающие выявить хорошую биодоступность молекулы ( per os ). Правило Липинского основано на молекулярной массе не более 500, содержании атомов N или О не более 10 и не более 5 групп ОН или NH в качестве доноров водородной связи, достаточной растворимости в воде (LogP ≤ 5). Фильтр Гхоша является его модификацией и основывается на коэффициенте LogP(–5,6 < logP < –0,4), молекулярной массе (160 < Мм < 480), молярной рефракции (40 < Mр < 130) и числе атомов (20 <  n атомов < 70). Правило Липинского выполнялось для всех соединений лишь на 75% из-за низкой растворимости, фильтр Гхоша для Диборнола и (3) не выполнялся на 100% из-за крайне низкой растворимости в воде (logP 8,16 и 6,64 соответственно).

Правило Опреи определяет вероятность для химического соединения быть потенциальным лекарственным средством как более высокую, если количество колец не более 3, жестких связей – не более 18 и вращающихся – не более 6. Правило Опреи не выполнялось для соединений (1) и (2) из-за низкого числа способных к ротации связей, их всего 2. Правила Вебера и Варма выполнялись для всех соединений.

Прогноз ADMET представлен в таблице 1. В этом прогнозе показана крайне низкая растворимость всех соединений в воде (менее 1 мг/л), высокая липофильность (logD7,4 > 3,5) с умеренным метаболизмом и плохая проницаемость липидного биослоя из-за низкой растворимости.

Таблица 1. Характеристики оценки лекарственного подобия по данным веб-сервера ADMETlab Table 1. Characteristics of druglikeness analysis based on data of ADMETlab Web server
Характеристики Parameters	2-((ди-н- 2,6-диизо-   2-гидрокси-    бутиламино) борнил-   3-изоборнил-   метил)-6-изо- 4-метил-     5-метил-     борнил-4-ме- фенол   бензальдегид    тилфенол 2,6-diisob-    2-hydroxy-      2-((di-n-bu- ornyl-      3-isobornyl-       tylamino) 4-methyl-     5-methyl-     methyl)-6-isob- phenol    benzaldehyde   ornyl-4-methyl- phenol
	1	2	3
Растворимость LogS, log моль/л (мг/мл) Solubility LogS, log mol/L (mg/mL)	–7,694 (0,008)	–5,576 (0,718)	–6,036 (0,342)
Липофильность LogD7,4 Distribution coefficient D LogD7,4	4,392	3,382	2,384
Липофильность LogP Distribution coefficient P LogP	8,163	5,046	6,643
PAPP (проницаемость Caco2), см/с PAPP (Caco-2 permeability), cm/s	–4,658	–4,493	–4,941
Способность ингибировать гликопротеинР Ability to inhibit glycopro-tein-P	–	+	++
Способность выступать субстратом гликопротеина-Р Ability to be glycopro-tein-P substrate	–	–	–
Абсорбция в кишечнике человека Human intestinal absorption	++	++	++
Биодоступность 30% (F30%) 30% Bioavailability (F30%)	+	+	–
Связывание с белками плазмы, % Рlasma protein binding, %	76,9	85,9	91,8
Объем распределения, л/кг Volume of distribution, L/kg	0,914	0,812	0,781
Способность проникать через гематоэнцефалический барьер Blood–brain barrier per meability	+++	+++	+++
Период полуэлиминации (T ½), ч Half life (T½), h	2,231	2,152	2,342
Клиренс, мл/мин*кг Clearance, mL/min*kg	1,7	1,89	1,92
Кардиотоксичность (блокада hERG ) Cardiotoxicity ( hERG blockade)	–	–	+
Гепатотоксичность Human hepatotoxicity	–	+	–
Кожная сенсибилизация Skin sensitization	–	+	+

Окончание табл. 1

End of table 1

Характеристики Parameters

2,6-диизо- 2-гидрокси-борнил- 3-изоборнил-4-метил-     5-метил фенол бензальдегид

2,6-diisob-    2-hydroxy- ornyl-      3-isobornyl-

4-methyl-     5-methyl- phenol benzaldehyde

2-((ди-н-бутиламино) метил)-6-изо-борнил-4-ме-тилфенол 2-((di-n-bu-tylamino) methyl)-6-isob-ornyl-4-methyl-phenol

12  3

LD50 при введении внутрь, –log моль/кг (мг/кг)

LD50 upon administration (LD50 of acute toxicity), –log mol/kg (mg/kg)

3,036 (348,5)

2,181

(1782,5)

2,8 (588,9)

Примечание: «+» – вероятность проявления качественного признака, «–» – вероятность проявления качественного признака незначительна.

Note: ‘’+’’ – probability of qualitative attribute manifestation,

‘’–’’ – the probability of manifestation of a qualitative attribute is negligible.

Значения кишечной проницаемости выше оптимального. Ресурс позволяет определять, является ли изучаемое соединение субстратом или ингибитором глико-протеина-P. Гликопротеин-P известен как переносчик лекарств, его превалирующая локализация – мембраны клеток слизистой оболочки кишечника, гепатоцитов, клеток, образующих гематоэнцефалический барьер. Высокая активность гликопротеина-Р снижает биодоступность лекарственных средств, уменьшает их способность к проникновению через гистогематические барьеры, вызывает множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. В ходе нашего исследования Диборнол не был определен как субстрат или ингибитор гликопроте-ина-Р, в то время как остальные изучаемые соединения могут быть его ингибиторами. Для всех трех соединений было показано, что абсорбция в кишечнике не превышает 30% (HIA), а биодоступность до 30% характерна для Диборнола и соединения (2). Согласно проведенным фармакокинетическим исследованиям, реальная биодоступность Диборнола в водном растворе при пероральном введении крысам в дозе 10 мг/кг составляет 25,5% [17]. Все соединения проявили способность связываться с белками плазмы крови и проникать через гематоэнцефалический барьер, что является характерным для высоколипофильных соединений. Связанная фракция составила 76,9% для Диборнола, 85,9% – для соединения (2), 91,8% – для соединения (3). При оценке возможного метаболизма было показано, что все изучаемые соединения являются субстратами цитохрома P450 CYP3A4 и P450 CYP2C19. Соединение (2) может выступать в качестве ингибитора P450 CYP1A2. Кроме того, соединение (3) проявляет свойства ингибитора P450 CYP2D6 и способно быть субстратом для P450 CYP2C9 и CYP3A. Период полувыведения для всех трех производных изоборнилфенолов является коротким (около 2 ч), а клиренс – медленным (не более 2 мл/мин*кг).

Потенциальной кардиотоксичностью (блокада hERG ) обладает соединение (3), а гепатотоксичностью (H-HT) – соединение (2). Также эти соединения способны вызывать сенсибилизацию кожи. Результат оценки мутагенности в расчетном тесте Эймса был отрицательным для всех соединений, как и возможность лекарственной травмы печени. При экстраполяции результатов доз от животных к человеку не выявлено потенциальных максимальных суточных доз. По результатам оценки острой токсичности (LD50) производные изоборнилфенола (2) и (3) показаны как низкотоксичные (501–5000 мг/кг), а Ди-борнол – как токсичное соединение (51–500 мг/кг). Сравнение полученных результатов с критериями глобальной системы классификации химических веществ [18] продемонстрировало, что соединения были отнесены к 4-му классу токсичности.

Программа TEST позволила сделать количественный расчет экологических характеристик токсичности (табл. 2).

Таблица 2. Параметры токсичности, определенные в программе TEST

Table 2. Toxicity parameters according to TEST software

Характеристики Parameters	2,6-диизоборнил-4-метилфенол 2,6-diisobornyl-4-methylphenol	2-гидрокси-3-изоборнил-5-метилбензальдегид 2-hydroxy-3-isobornyl-5-methylbenzaldehyde	2-((ди-н-бутиламино)метил)-6-изоборнил-4-метилфенол 2-((di-n-butylamino) methyl)-6-isobornyl-4-methylphenol
	1	2	3
Fathead minnow LC50 96 ч, log10 моль/л Fathead minnow LC50 96 h, log10 mol/L	6,56	5,64	6,14
Fathead minnow LC50 96 ч, мг/л Fathead minnow LC50 96 h, mg/L	0,1	0,63	0,28
Daphnia magna LC50 48 ч, log10 моль/л Daphnia magna LC50 48 h, log10 mol/L	6,55	5,63	5,93
Daphnia magna LC50 48 ч, мг/л Daphnia magna LC50 48 h, mg/L	0,11	0,64	0,46
T. pyriformis IGC50 48 ч, log10 моль/л T. pyriformis IGC50 48 h, mol/L	–	4,68	6,33
T. pyriformis IGC50 48 ч, мг/л T. pyriformis IGC50 48 h, mg/L	–	5,66	0,18
LD50 при приеме внутрь (крысы) log10, моль/кг Oral rat LD50 log10, mol/kg	3,97	2,09	3,00
LD50 при приеме внутрь (крысы), мг/кг Oral rat LD50, mg/kg	40,36	2210,87	385,16

Окончание табл. 2

End of table 2

Характеристики Parameters	2,6-диизоборнил-4-метилфенол 2,6-diisobornyl-4-methylphenol	2-гидрокси-3-изоборнил-5-метилбензальдегид 2-hydroxy-3-isobornyl-5-methylbenzaldehyde	2-((ди-н-бутиламино)метил)-6-изоборнил-4-метилфенол 2-((di-n-butylamino) methyl)-6-isobornyl-4-methylphenol
	1	2	3
Биоаккумуляция Bioaccumulation factor	–	3,24	169,32
Токсичность Developmental toxicant	Не токсично Non toxic	Токсично Toxic	Токсично Toxic
Мутагенность Mutagenicity	–	Отсутствует Negative	Отсутствует Negative
Растворимость в воде, log10 моль/л Solubility in water, log10 mol/L	6,33	3,54	4,58
Растворимость в воде, мг/л Solubility in water, mg/L	0,18	80,89	10,18

Примечание: «–» – расчет невозможен или вне модели.

Note: ‘’–’’ – calculation is impossible or beyond the model.

Сравнение полученных результатов с критериями, согласно глобальной системе классификации химических веществ [18], показало, что соединения были отнесены ко 2-му классу токсичности. Рассчитанные дозы LD50 коррелируют с дозами, полученными по результатам анализа ADMETlab, но несколько отличаются. Расчетная летальная концентрация, вызывающая гибель 50% экспериментальных объектов в течение 96 ч (LC50 96 ч) для рыб Fathead minnow и расчетная летальная концентрация, вызывающая гибель 50% экспериментальных объектов в течение 48 ч (LC50 48 ч) для водных рачков Daphnia magna, составили менее 1 мг/л для всех соединений. Одним из дескрипторов этой модели, оказывающих значимое влияние на результат, является водорастворимость. Была показана крайне низкая растворимость (0,18 мг/л) для Диборнола, для остальных соединений она не превышала 100 мг/л. Поскольку водорастворимость определена как очень низкая, соответственно, все рассчитываемые показатели могут быть смещены в негативную сторону. Для Диборнола расчет острой токсичности (концентрация вещества, при которой подавляется 50% роста (IGC50) популяции инфузорий Tetrahymena pyriformis в течение 48 ч), не входит в область применения модели. Расчет коэффициента биоаккумуляции также был расценен как ненадежный для всех соединений. Расчет токсичности при приеме внутрь у крыс определил Диборнол как соединение, относящееся к 3-му классу токсичности, (3) – к 4-му классу, (2) – к 5-му классу токсичности. В то же время Диборнол был определен как соединение, не обладающее токсичностью в период развития организма (Developmental toxicant).

Сервер ProTox_II показал значения острой токсичности при приеме внутрь у крыс для соединений (2) и