Оценка функционального состояния нейтрофилов крови человека, основанная на регистрации продукции активных форм галогенов

DOI:

ББК 28.707.4

ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ОСНОВАННАЯ НА РЕГИСТРАЦИИ ПРОДУКЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ ГАЛОГЕНОВ

Дарья Владимировна Григорьева

Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь

Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь

Вероника Евгеньевна Луценко

Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь

Сергей Николаевич Черенкевич

Белорусский государственный университет, г. Минск, Республика Беларусь

Олег Михайлович Панасенко

ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, г. Москва, Российская Федерация

Алексей Викторович Соколов

Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация

Введение. Воспалительная реакция организма сопровождается активацией нейтрофилов, активно фагоцитирующих бактерии и собственные дефектные клетки организма. Учитывая их важную роль в развитии воспалительной реакции [4], актуальной задачей является разработка адекватных способов контроля функционального состояния этих клеток. Нейтрофилы проявляют различную функциональную активность: продукция активных форм кислорода (АФК) и галогенов (АФГ), секреция антимикробных гранулярных белков (миелопероксидазы (МПО), эластазы, катепсинов и др.), NETоз и др. [3], регистрируемую с применением различных методов. Однако помимо очевидного недостатка в дороговизне использования ряда подходов, исследователи сталкиваются также с методическими сложностями, одна из которых заключается в том, что рецепторы на поверхности нейтрофилов гликозилированы, а секретируемые данными клетками белки, проявляя лектино-подобную активность, способны по аутокринному механизму дополнительно активировать нейтрофилы.

В данной работе для оценки функциональной активности нейтрофилов нами был использован комплексный подход, включающий регистрацию генерации АФК нейтрофи- лами в результате функционирования НАДФН-оксидазного комплекса, дегрануляции азурофильных гранул, а также продукции АФГ, образующихся в реакциях, катализируемых ферментом азурофильных гранул нейтрофилов – МПО в присутствии субстратов (Н2О2 и ионов галогенидов).

Материалы и методы. Нейтрофилы выделяли из донорской крови, стабилизированной цитратом натрия, путем центрифугирования с использованием декстрана T70 и гистопака-1077. Продукцию Н2О2 оценивали флуоресцентным методом с использованием скополетина в качестве субстрата пероксидазной реакции (лвозб./флуор. = 350/460 нм). Образование HOCl и ее производных регистрировали недавно разработанным нами высокоспецифичным флуоресцентным методом с применением целестинового синего В (СВ), при окислении которого АФГ образуется флуоресцирующий продукт – гликоль СВ (лвозб./флуор. = 490/580 нм) [1]. Дегрануляцию азурофильных гранул оценивали по выходу эластазы (флуоресцентным методом с использованием специфического субстрата эластазы – MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-MCA, при расщеплении которого высвобождается флуорофор – ами-нометилкумарин (лвозб./флуор. = 380/460 нм)) – и МПО (по пероксидазной активности фермента, регистрируемой спектрофотометрическим методом (л = 460 нм) по окислению хромогенного субстрата о-дианизидина).

В качестве агонистов нейтрофилов использовали различные стимуляторы: хемотаксический пептид N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), форболовый эфир фор-бол 12-миристат 13-ацетат (PMA), а также растительные лектины с различной углеводной специфичностью (CAA ( Caragana arborescens агглютинин), специфичный к остаткам GalNAc, Gal и GlcNAc; WGA ( Triticum vulgaris агглютинин), специфичный к остаткам GlcNAc и NeuNAc; PHA-L ( Phaseolus vulgaris агглютинин), специфичный к остаткам Gal, GlcNAc и Man; маннозо-специфичный Con A ( Canavalia ensiformis агглютинин); SNA ( Sambucus nigra агглютинин), специфичный к остаткам NeuNAc, Gal и GalNAc; SBA ( Glycine max агглютинин), специфичный к остаткам GalNAc, Gal и Glc; Gal/GalNAc-специ-фичный PNA ( Arachis hypogaea агглютинин) и GlcNAc-специфичный UDA ( Urtica dioica агглютинин)).

Результаты и их обсуждение. В таблице приведены данные по влиянию всех вышеперечисленных соединений на генерацию Н₂О₂, экзоцитоз эластазы и МПО из азу-рофильных гранул, а также продукцию HOCl и ее производных активированными нейтрофилами.

Известно, что для экзоцитоза содержимого азурофильных гранул и, следовательно, продукции АФГ нейтрофилами, при действии на клетки растворимых стимулов (лектины, fMLP), активирующих нейтрофилы по рецеп-тор-зависимому механизму, необходима предварительная инкубация нейтрофилов с цитохалазином В (cyt В), препятствующим полимеризации фибриллярного актина цитоскелета [6]. PMA, являясь липофильным соединением, легко проникает в клетки и инициирует респираторный взрыв и дегрануляцию нейтрофилов [2] и без помощи cyt B.

Как показано в таблице, fMLP и PMA вызывали продукцию Н2О2 и экзоцитоз содержимого азурофильных гранул нейтрофилов. Наличие во внеклеточной среде МПО, Н2О2 и Cl– предполагает образование HOCl и ее производных, что и было продемонстрировано нами с помощью недавно разработанного флуоресцентного метода, основанного на регистрации во внеклеточной среде увеличения интенсивности флуоресценции гликоля СВ, образующегося при окислении СВ HOCl и ее производными.

Далее нами был проведен скрининг растительных лектинов, которые, как известно, способны специфически связываться с различными гликозилированными структурами на поверхности нейтрофилов, что приводит к за-

Влияние агонистов различной природы на генерацию Н2О2

(скорость окисления скополетина), экзоцитоз эластазы и МПО, а также продукцию HOCl и ее производных (скорость образования гликоля СВ) нейтрофилами

Активатор, концентрация	Скорость окисления скополетина, усл. ед./мин	Активность эластазы, усл. ед./мин	Активность МПО, Δ D 460 /мин	Скорость образования гликоля СВ, усл. ед./мин
Контроль (без активатора)	0	0,19±0,03	0,013±0,0025	0
fMLP, 1 мкМ	24,33±3,95*	7,17±0,51*	0,025±0,0013*	0,029±0,004*
PMA, 50 нМ	22,29±1,90*	8,05±1,07*	0,015±0,0002*	0,021±0,004*
CAA, 100 мкг/мл	2,01±0,38*	0,34±0,03*	0,060±0,0095*	0,032±0,009*
WGA, 50 мкг/мл	1,20±0,18*	3,59±0,46*	0,045±0,0068*	0,016±0,003*
PHA-L, 100 мкг/мл	1,11±0,37*	0,58±0,03*	0,058±0,0088*	0,014±0,001*
Con A, 100 мкг/мл	0,98±0,21*	0,72±0,01*	0,0084±0,0034	0,014±0,005*
SNA, 100 мкг/мл	1,31±0,08*	0,09±0,11	0,023±0,0057	0
SBA, 100 мкг/мл	0,99±0,17*	0,18±0,03	0,012±0,0062	0
PNA, 100 мкг/мл	0,78±0,11*	0,15±0,05	0,016±0,009	0
UDA, 100 мкг/мл	0,36±0,10*	0,02±0,13	0,0031±0,0017	0

Примечание. Данные представлены как среднее ± среднеквадратичная ошибка среднего, вычисленные по результатам 7 независимых экспериментов. *р<0,05 по сравнению с ответом клеток в отсутствие стимулятора.

пуску ряда процессов внутриклеточной сигнализации и, в конечном итоге, к активации клеток [5]. Как видно из данных, представленных в таблице, все используемые в данной работе лектины стимулировали активацию НАДФН-оксидазы и, следовательно, продукцию Н2О2 нейтрофилами, однако скорость окисления скополетина различалась для разных лектинов. Экзоцитоз МПО, регистрируемый по пероксидазной активности фермента в супернатантах активированных нейтрофилов, был достоверно выше по сравнению с контролем только после инкубации клеток с CAA, WGA и PHA-L. При исследовании продукции HOCl и ее производных увеличение интенсивности флуоресценции гликоля СВ в суспензии нейтрофилов было зарегистрировано не только при действии лектинов, вызывающих экзо-цитоз МПО, но также и при действии Con A. При последующем исследовании дегрануляции азурофильных гранул по регистрации во внеклеточной среде нейтрофильной эластазы, было установлено, что Con A вызывает экзо-цитоз эластазы, а значит и других компонентов азурофильных гранул, включая МПО. Учитывая тот факт, что в состав молекулы МПО входят 5 N-гликанов, представленных в основном структурами с высоким содержанием маннозы, отсутствие экзоцитоза МПО при действии Con A может быть ассоциировано со связыванием высвобождающейся из азурофильных гранул нейтрофилов МПО с уже находящимся на поверхности нейтрофилов Con A и последующей ее преципитацией вместе с клетками.

Заключение. На основании полученных данных можно заключить, что при необходимости универсальной оценки функциональной активности нейтрофилов наиболее рациональным будет применение флуоресцентного ме- тода с использованием целестинового синего В, позволяющего оценивать продукцию клетками гипогалоидных кислот и их производных, необходимыми условиями образования которых являются высвобождение МПО в результате дегрануляции и наличие ее субстрата – Н2О2, образующегося при респираторном взрыве нейтрофилов.