Оценка генотоксичности перекиси водорода и антиоксидантного действия галловой кислоты методом ДНК-комет с использованием модели перевиваемых клеточных культур

DOI:

ББК 28с

ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА

И АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ГАЛЛОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ДНК-КОМЕТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Ольга Владимировна Верле

Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград, Российская Федерация

Олег Владимирович Островский

Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград, Российская Федерация

Валериан Евгеньевич Веровский

Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград, Российская Федерация

Галина Петровна Дудченко

Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград, Российская Федерация

Введение. Изучение повреждений ДНК в условиях окислительного стресса (ОС), индуцированного in vitro , позволяет с достаточной долей вероятности исключить прочие эндогенные и экзогенные факторы как возможную причину разрывов нитей нуклеиновой кислоты (НК). Преимуществом использования in vitro моделей является возможность культивирования широкого спектра клеточных линий, а при использовании клеток человека минимизируются проблемы межвидовой экстраполяции. В настоящее время наиболее привлекательным для оценки генотоксичности представляется метод ДНК-комет (Comet assay), впервые описанный Ostling и Johansson в 1984 г. [3]. Существует большое количество протоколов и методических рекомендаций, регламентирующих порядок проведения анализа, но зачастую перед исследователями стоит проблема стандартизации, поскольку не существует унифицированных подходов к оценке антиоксидантов (АО) в отношении защиты НК от ОС. Однако на основе использования метода ДНК-комет при различных условиях индукции ОС появляется возможность разработать биологическую модель для изучения действия АО.

Цель работы. Оценить степень дефрагментации ДНК методом ДНК-комет при воздействии на клеточную культуру перекиси водорода (H₂O₂) и разработать in vitro модель, пригодную для оценки антиоксидантной активности новых фармакологических препаратов.

Материалы и методы

Культуры клеток. Исследование проводилось на 2 монослойных клеточных ли- ниях: Hela и Vero. Последние культивировались на питательной среде DMEM, а HeLa – на питательной среде Игла. Полную питательную среду получали путем добавления 10 %-й эмбриональной сыворотки, глутамина и смеси антибиотиков пенициллин-стреп-томицин. Культуральные флаконы и планшеты инкубировали в СO2 – инкубаторе при концентрации CO2 – 5 % и относительной влажности не менее 90 %. Для проведения эксперимента использовались клетки через 24 часа после пересева.

Метод ДНК-комет. Метод ДНК-комет использовали в соответствии с валидированным протоколом и методическими рекомендациями [1; 2]. 20 мкл клеточной суспензии вносили в пробирки с 180 мкл 0,5 % раствора легкоплавкой агарозы в фосфатно-солевом буфере. Затем 100 мкл полученной смеси наносили на предметные стекла и помещали на лед. Все последующие операции проводили в затемненном помещении при желтом свете. После затвердевания агарозы микропрепараты помещали в предварительно охлажденный до 4 °С лизирующий буфер (10 mM Tris-HCl (pH=10), 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA-Na 2,1 % TritonX-100, 10 % ДМСО) и инкубировали 1 час. Затем микропрепараты переносили в охлажденный до 4 °С буфер для электрофореза (300 mM NaOH, 1mM EDTA-Na2 (pH>13)) и инкубировали в течение 20 минут для щелочной денатурации ДНК, после чего переносили в камеру для электрофореза со свежей порцией охлажденного буфера. Электрофорез проводили в течение 20 минут при напряженности поля 1 V/см и силе тока ~300 mA. По окончании электрофореза микропрепараты фиксировали 10 минут в 70 % этиловом спирте, а затем окрашивали в темноте красителем SYBR GreenI (1:10000 в ТЕ-буфере (рН=8,5)) в течение 30 минут. Полученные препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе при длине волны 530 нм. С каждого микропрепарата анализировали не менее 100 ДНК-комет. В качестве показателя поврежденнос-ти ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (% ДНК в хвосте). Обработку изображений производили в программе CaspLab 1.2.2. Статистическую обработку экспериментальных данных существ-ляли с помощью пакетов программ: Excel из пакета Office XP («Microsoft», США), Statistica 6.0. Оценку результатов проводили по каждой клеточной линии путем сравнения показателей поврежденности ДНК в опытной и контрольной группах. Критериями положительного результата являются статистически достоверное, дозозависимое увеличение показателя поврежденности ДНК при одном и том же сроке экспозиции, а также статистически достоверный, воспроизводимый эффект в нескольких аналитических сериях.

Полученные результаты. Одна из целей исследования – достичь уровня повреждения ДНК 40 % и более для возможности использования полученной модели для тестирования новых фармакологических препаратов, влияющих на репарацию, и препаратов с антиоксидантной активностью.

Перед началом моделирования окислительного повреждения ДНК было необходимо оценить степень дефрагментации ДНК интактных клеток. Используя различные техники снятия клеточного монослоя, был установлен уровень повреждения ДНК в клеточных линиях HeLa и Vero – менее 1 %. Это является допустимым для интактных клеток и дает возможность выявления генотоксических свойств веществ.

В дальнейшем эксперименте использовали схему с однократным воздействием H2O2 на исследуемые клеточные культуры. Для индукции окислительного повреждения ДНК использовали H2O2 в конечной концентрации 100, 200, 400, 700, 1000 и 1300 мкМ в бессывороточной среде. В результате проведенных исследований было получено достоверное увеличение % ДНК в хвосте в исследуемом диапазоне концентраций. При исполь- зовании H2O2 от 400 мкМ степень повреждения выходит на плато, а прирост повреждений составляет в среднем 5 %. Наибольший скачок в повреждении ДНК наблюдается между 100 и 200 мкМ. При подсчете % ДНК в хвосте были обнаружены клетки с уровнем повреждения ДНК 85 % и выше. Клетки с таким уровнем повреждения имеют небольшое ядро-голову и большой диффузный хвост и представляют собой апоптотические клетки, в которых процессы репарации невозможны. Такие изображения получили название коме-ты-«ежики» («hedgehog» comets). После проведения регрессионного анализа была обнаружена зависимость между возрастанием концентрации перекиси водорода и количеством клеток «ежиков», что является весьма логичным.

После разработки модели повреждения ДНК было решено проверить, как будет изменяться степень дефрагментации ДНК в присутствии веществ с АО активностью. В качестве вещества с АО активностью была выбрана ГК. Галловую кислоту добавляли в концентрации 25 мкМ, так как эта концентрация не проявляет цитотоксических свойств на опухолевые и нормальные клетки. ГК добавляли непосредственно перед индукцией ОС в качестве ингибитора образования свободных радикалов. В присутствии ГК значительно снижался уровень повреждения ДНК в обеих клеточных линиях. Так, процент повреждения ДНК в клетках HeLa при воздействии максимальной концентрации H2O2 составляет более 70 %, а в присутствии ГК – 23 %. Аналогичные изменения наблюдаются и в клеточной линии Vero.

Заключение. Основное преимущество метода ДНК-комет заключается в возможности детекции повреждений на уровне одиночных клеток эукариотов практически любого происхождения. На первом этапе работы с клеточными линиями было выяснено, что процент повреждения генетического материала клеток интактных образцов мало отличается от способа снятия клеточного монослоя с культурального пластика. Далее было проанализировано влияние H₂O₂ как индуктора ОС на повреждение ДНК клетки. В своих экспериментах мы смоделировали оптимальный уровень дефрагментации ДНК для последующих исследований защитного действия АО.