Оценка in vitro антимикобактериальной активности биорезорбируемых имплантатов, импрегнированных наночастицами серебра и антимикобактериальными препаратами, в лечении туберкулеза легких

EDN: KCKIOT

¹ Введение. Хирургия остается неотъемлемой составляющей комплексного подхода к лечению туберкулеза легких. Распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis со множественной и широкой лекарственной устойчивостью существенно снижает эффективность стандартной химиотерапии, которая, по данным глобальных отчетов Всемирной организации здравоохранения, не превышает 71% [1]. В этих условиях хирургические методы лечения приобретают особую значимость, обеспечивая показатели эффективности до 96,2% [2].

Деструктивные формы туберкулеза легких нередко сопровождаются значительным разрушением легочной ткани с образованием полостей (каверн), которые не могут быть излечены без операции. Одним из перспективных направлений торакальной хирургии является экстраплевральная пломбировка - операция, при которой в сформированную экстраплевральную полость устанавливается имплантат, обеспечивающий коллапс пораженного участка легкого. Данный метод более эффективен и менее травматичен по сравнению с классической торакопластикой, а также позволяет достичь необходимого объема коллапса без существенного косметического дефекта грудной стенки [3, 4].

Однако широкое внедрение экстраплевральной пломбировки в клиническую практику сдерживается отсутствием оптимального пломбировочного материала. Исторически для этих целей применялись различные субстанции – от парафиновых масел и силиконовых шариков до аутологичных тканей, – каждая из которых имела существенные недостатки в виде быстрой резорбции, миграции имплантата, инфекционных осложнений, отторжения материала [5]. Идеальный пломбировочный материал должен соответствовать ряду требований, таких как биосовместимость, биодеградация, отсутствие токсичности, способность поддерживать необходимый объем в течение определенного периода и, что особенно важно, - возможность оказывать местное антимикробное действие на возбудителя туберкулеза легких [6].

Современные достижения в области биоматериалов и регенеративной медицины открывают новые возможности для решения этой проблемы. Разработаны биорезорбируемые пористые материалы на основе полилактида (ПЛА), поликапролактона (ПКЛ) и хитозана, которые показали высокую биосовместимость и контролируемую деградацию в исследованиях in vivo [5, 7]. Пористая структура таких материалов создает условия для импрегнации лекарственных препаратов с последующим их пролонгированным высвобождением в зоне имплантации. Создание локальной антимикобактериальной среды может существенно повысить эффективность лечения и снизить риск послеоперационных осложнений [6, 7].

Наряду с традиционными противотуберкулезными препаратами (ПТП) в качестве потенциальных антимикробных агентов рассматриваются препараты серебра. В условиях глобального кризиса

антибиотикорезистентности наночастицы серебра привлекают внимание исследователей благодаря широкому спектру антимикробного действия и доказанной активности в отношении микобактерий. Механизм их действия включает нарушение целостности клеточной стенки, генерацию активных форм кислорода и взаимодействие с внутриклеточными структурами, что делает формирование резистентности маловероятным [8].

Цель - оценить антимикобактериальную активность биорезорбируемых имплантатов на основе ПЛА, ПКЛ и хитозана, насыщенных наночастицами серебра и ПТП.

Материал и методы. Исследование выполнено на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» Минздрава России совместно с ФГБУ «Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»» (далее - НИЦ «Курчатовский институт») в рамках исследовательской программы по разработке объемных имплантатов для торакальной хирургии.

Получение образцов имплантатов с наночастицами серебра. В НИЦ «Курчатовский институт» синтезированы образцы внешней оболочки объемных пористых композиционных материалов из ПЛА/ ПКЛ с оболочкой из хитозана. Наночастицы серебра получали методом in situ -восстановления из раствора хитозана. Для реализации данного метода готовили 1% раствор хитозана Primex 43000 с 1,04% серебра азотнокислого – AgNO₃ (РеаХим 99,95, ГОСТ 1277-75) в 2%-й уксусной кислоте и инкубировали при температуре 60⁰С в течение 5 сут. В результате получены наночастицы серебра преимущественно сферической формы с преобладающей фракцией размером 2–20 нм и агрегаты с размером 25–200 нм, стабилизированные оболочкой из полисахарида.

Протеинат серебра как водорастворимое соединение был выбран для сравнительной оценки анти-микобактериальной активности различных форм серебра. Для получения образцов с протеинатом серебра к раствору хитозана с глутаровым альдегидом добавляли 3 мл водного раствора протеината серебра с концентрациями 66,7 мг/мл («хитозан Пр», итоговая концентрация 20 мг/мл) и 133,3 мг/мл («хитозан Пр2», итоговая концентрация 40 мг/мл). Контрольным образцом служила оболочка без добавления антимикробных препаратов. Морфология полученных материалов была изучена методом растровой электронной микроскопии, подтвердившей сохранение пористой структуры для всех типов материалов. Концентрации наночастиц серебра выражены в нмоль/мл ввиду коллоидной природы дисперсии, тогда как для протеината серебра использованы единицы мг/мл как для молекулярного соединения.

Получение образцов имплантатов с противотуберкулезными препаратами. Для исследования использовали химически чистые субстанции 7 ПТП производства NANJING PARS BIOCHEM (Китай): деламанид, линезолид, бедаквилин, моксиф-локсацин, капреомицин, изониазид и амикацин. ПТП импрегнировались в ядро имплантата из сополимера ПЛА/ПКЛ с целью достижения пролонгированного или модифицированного высвобождения действующих веществ в различных концентрациях, представленных в табл. 1.

Таблица 1

Концентрации противотуберкулезных препаратов, импрегнированных в имплантаты на основе полилактида / поликапролактона

Препарат	Концентрация, мкг
	1	2
Деламанид	0,015	0,005
Линезолид	0,03	0,015
Бедаквилин	0,015	0,005
Моксифлоксацин	0,045	0,03
Капреомицин	0,0125	0,01875
Изониазид	0,00375	0,005
Амикацин	0,00625	0,0125

Примечание . Концентрация указана как масса препарата в 1 имплантате.

Выбор относительно низких концентраций препаратов был обусловлен двумя факторами. Во-первых, малый объем имплантатов и высокая пористость материала ядра, необходимая для обеспечения биосовместимости и контролируемой биодеградации, ограничивали максимально возможную дозу импрег-нируемого вещества без риска нарушения структурной целостности пористой матрицы. Во-вторых, использование двух различных концентраций для каждого препарата было методологически обосновано необходимостью изучения зависимости между дозой импрегнированного вещества и продолжительностью его высвобождения, при этом меньшая концентрация служила контролем для оценки сохранения антимикобактериальной активности при минимальных дозах.

Моделирование условий высвобождения препаратов. Образцы имплантатов с ПТП помещали в фосфатно-солевой буфер («ПанЭко», Россия) для моделирования физиологических условий в легочной ткани. На каждый препарат приходилось 3 испытуемых образца и 1 – контрольный. В испытуемых образцах проводили ежедневную смену буфера с отбором аликвоты (элюата) для оценки антимикобак-териальной активности. В контрольном образце буфер не меняли для оценки стабильности препарата в растворе. Контрольные точки исследования: 1, 3, 7, 14, 21 и 28-е сутки. Длительность эксперимента составила 28 дней.

Микробиологические методы исследования. Для определения антимикобактериальной активности использовали чистую культуру контрольного штамма M. tuberculosis H37Rv, чувствительного ко всем исследуемым препаратам. Готовили суспензию в 0,9% растворе хлорида натрия согласно стандарту мутности по МакФарланду 0,5 ед. (1×10⁷ КОЕ/мл).

Метод диффузии в агар. В чашки Петри разливали 25 мл агаровой среды Middlebrook 7H11 (BD, США). После застывания 100 мкл суспензии M. tuberculosis H37Rv засевали «сплошным газоном» с помощью шпателя Дригальского. На поверхность агара помещали образцы имплантатов с наночастицами серебра. Образцы хитозановой оболочки имели дискообразную форму диаметром 4 мм и толщиной 2 мм. Инкубировали при 35±2⁰С не менее 14 дней. Учет результатов проводили при формировании бактериального газона путем измерения диаметров зон задержки роста в миллиметрах.

Метод определения антимикобактериаль-ной активности в системе жидких культур BACTEC MGIT 960. Использовали пробирки с 10 мл жидкой среды Middlebrook 7H9 и 750 мкл ростовой добавки OADC (Middlebrook OADC Enrichment, BD, США). В пробирки вносили образцы имплантатов с ПТП и наночастицами серебра и 100 мкл суспензии M. tuberculosis H37Rv. Для пробирок с элюатом использовали разведение инокулюма 1:5 (1×10⁷ КОЕ/мл), для контрольной пробирки – 1:500 (1×10⁵ КОЕ/мл). Инкубацию проводили до достижения контрольной пробиркой 400 ростовых единиц. Результат оценивали по показателю ростовых единиц: менее 100 – чувствительный (S), более 100 – резистентный (R).

Метод микроразведений в бульоне. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили 100 мкл среды Middlebrook 7H9/OADC (BD, США), исследуемый элюат и готовый инокулюм. Планшеты инкубировали при 35±2⁰С в течение 14–21 дня с последующей визуальной оценкой роста.

Для всех методов устанавливали следующие кон-троли: отрицательный контроль (контаминационный контроль условий засева), положительный контроль роста штамма M. tuberculosis H37Rv, контроль отсутствия антимикробной активности носителя (хитозана или ПЛА/ПКЛ без действующего вещества).

Результаты. Антимикобактериальная активность композитных имплантатов с наночастицами серебра. Предварительная оценка кон-тролей подтвердила валидность экспериментов. Так, во всех отрицательных контролях отсутствовал рост, что свидетельствовало о соблюдении асептических условий. Во всех положительных контролях наблюдался равномерный рост M. tuberculosis H37Rv, а на чашках с имплантатом без действующего вещества рост культуры не подавлялся, что подтвердило отсутствие собственной антимикобактериальной активности носителя. Формирование видимого бактериального газона в положительном контроле на среде Middlebrook 7H11 наблюдалось на 14-е сутки инкубации. В системе BACTEC MGIT 960 контрольная пробирка достигла 400 ростовых единиц на 6-е сутки.

При исследовании имплантатов, импрегнирован-ных наночастицами серебра, методом диффузии в агар выявлена зона задержки роста 7 мм для обеих концентраций (0,017–0,021 и 0,034–0,042 нмоль/мл). Следует отметить, что зоны задержки роста у имплантатов с наночастицами серебра характеризовались более четкими границами и выраженным контуром по сравнению с имплантатами, содержащими протеинат серебра.

Принципиально важные результаты получены при определении антимикобактериальной активности в системе жидких культур BACTEC MGIT 960. В пробирках с контрольным имплантатом без действующего вещества начало роста культуры зарегистрировано на 6-е сутки. При использовании имплантатов с низкой концентрацией наночастиц серебра (0,017–0,021 нмоль/мл) точка начала роста сместилась на 16-е сутки, что свидетельствует о значительном антимикробном эффекте. Наиболее выраженный результат продемонстрировали имплантаты с высокой концентрацией наночастиц серебра (0,034–

0,042 нмоль/мл), где наблюдалось полное ингибирование роста культуры M. tuberculosis H37Rv в стандартные сроки наблюдения.

Для оценки продолжительности антимикобак-териального действия пробирки с имплантатами, содержащими высокую концентрацию наночастиц серебра, были оставлены в системе BACTEC MGIT 960 для продленного наблюдения. Положительный результат в виде начала роста культуры был зафиксирован на 35-е сутки, что свидетельствует о пролонгированном бактерицидном эффекте и постепенной элюции серебра из имплантата в течение более чем одного месяца (табл. 2).

Антимикобактериальная активность имплантатов с протеинатом серебра. Исследование имплантатов, импрегнированных протеинатом серебра в концентрациях 20 и 40 мг/ мл, выявило зону задержки роста 7 мм для обеих концентраций, что свидетельствует о слабой антимикобактериальной активности данного препарата. При исследовании в системе BACTEC MGIT 960 начало роста культуры M. tuberculosis H37Rv было зафиксировано на 11-е сутки независимо от концентрации препарата (в контроле – на 6-е сутки). Таким образом, протеинат серебра обеспечивал только незначительную задержку роста (5 сут) по сравнению с контролем, что не позволяет рассматривать его как эффективный антимикобакте-риальный агент для импрегнации имплантатов без существенного увеличения концентрации.

Высвобождение противотуберкулезных препаратов из имплантатов на основе полилактида / поликапролактона. Антимикобактериальная активность элюатов оценивалась 2 методами – микроразведений в бульоне и в системе BACTEC MGIT 960. Результаты обоих методов совпали во всех контрольных точках для каждого из исследованных препаратов. Исследование элюатов, полученных из имплантатов, импрегнированных ПТП, выявило важную закономерность – для всех изученных препаратов антимикобактериальная активность в элюатах определялась в течение первых 1–3 сут эксперимента. При этом в контрольных образцах, где буфер не менялся на протяжении всего эксперимента, антими-кобактериальная активность сохранялась в течение всех 28 сут наблюдения (табл. 3).

В отличие от других препаратов деламанид не проявил антимикобактериальной активности ни в одной из контрольных точек, включая контрольный образец без смены буфера. Это говорит о непригодности данного препарата для импрегнации в имплантаты, что, вероятно, связано с особенностями его химической структуры.

Дополнительное исследование с использованием сниженных доз препаратов (амикацина 0,005 мкг, капреомицина 0,01 мкг, изониазида 0,003 мкг) не привело к улучшению результатов, и профиль элюции оставался аналогичным, т.е. активность определялась только в первые 3–7 сут. Данный факт подтверждает, что лимитирующим фактором является не только концентрация препарата, но и структурные особенности имплантатов.

Обсуждение. Полученные результаты наглядно демонстрируют принципиальные различия в эффективности 2 исследованных систем доставки

Таблица 2

Антимикобактериальная активность имплантатов с различными формами серебра

Образец	Зона задержки роста, мм	Начало роста, сут (BACTEC)
Хитозан (контроль)	0	6
Наночастицы серебра, нмоль/мл
0,017–0,021	7	16
0,034–0,042	7	35*
Протеинат серебра, мг/мл
20	7	11
40	7	11

Примечание. *Полное подавление роста в стандартные сроки (28 сут), рост зафиксирован при продленном наблюдении.

Таблица 3

Динамика антимикобактериальной активности элюатов из имплантатов на основе полилактида / поликапролактона

Препарат	Эксперимент, сут						Контроль (28 сут)
	1	3	7	14	21	28
Капреомицин	+	+	–	–	–	–	+
Изониазид	+	+	–	–	–	–	+
Амикацин	+	+	–	–	–	–	+
Моксифлоксацин	+	+	–	–	–	–	+
Бедаквилин	+	–	–	–	–	–	+
Линезолид	+	+/–*	–	–	–	–	+
Деламанид	–	–	–	–	–	–	–

Примечание. Антимикобактериальная активность: «+» – наличие; «–» – отсутствие; * – активность зависела от концентрации импрегнации (0,03 мкг – активен, 0,015 мкг – неактивен).

антимикробных агентов для потенциального применения в хирургии туберкулеза легких.

Имплантаты, содержащие наночастицы серебра, показали наиболее выраженные результаты. Пролонгированное антимикобактериальное действие в течение 35 сут при использовании высокой концентрации наночастиц (0,034–0,042 нмоль/мл) представляет значительный клинический интерес, так как этот период охватывает критическую фазу послеоперационного периода, когда риск развития инфекционных осложнений наиболее высок. Ряд исследований показал, что механизм антимикобакте-риального действия наночастиц серебра реализуется через повреждение клеточной стенки и мембраны микобактерий, генерацию активных форм кислорода, взаимодействие с тиоловыми группами белков и ингибирование репликации ДНК [8, 9]. Множественность мишеней воздействия делает маловероятным развитие резистентности, что особенно важно в контексте лечения туберкулеза со множественной и широкой лекарственной устойчивостью.

Важным преимуществом хитозана как носителя является его собственная биологическая активность. Хитозан обладает гемостатическими, регенеративными и иммуномодулирующими свойствами, что может дополнительно способствовать заживлению в зоне имплантации [10]. При этом в нашем исследовании подтверждено отсутствие у хитозана собственной антимикобактериальной активности, что позволяет корректно оценивать вклад импрегнированных веществ в общий терапевтический эффект.

В нашем исследовании протеинат серебра, несмотря на давно известные антисептические свойства и широкое применение в медицине, показал более слабую антимикобактериальную активность по сравнению с контролем. Задержка роста культуры на 5 сут (11 сут против 6 сут в контроле) является недостаточной и не позволяет рассматривать протеинат серебра как эффективный антимикобактериаль-ный агент для импрегнации имплантатов. Вероятно, такой результат связан с различиями в механизмах действия, поскольку протеинат серебра представляет собой комплекс с белком, который ограничивает высвобождение ионов серебра и снижает их биодоступность по сравнению со свободными наночастицами [11].

Результаты исследования имплантатов с ПТП выявили быструю и практически полную элюцию препаратов в первые 1–3 сут. Данный профиль элюции важен именно в первые сутки после операции для предотвращения ранних специфических послеоперационных осложнений, но для терапии недостаточен и требует проведения системной химиотерапии [12].

Причины наблюдаемого феномена могут быть связаны с несколькими факторами. Во-первых, высокая пористость материала, обеспечивающая его биосовместимость и способность к биодеградации, одновременно создает условия для быстрой диффузии импрегнированных препаратов в окружающую среду. Во-вторых, гидрофильные ПТП могут недостаточно прочно связываться с гидрофобной полимерной матрицей ПЛА/ПКЛ. В-третьих, размер пор и их взаимосвязанность могут способствовать быстрому вымыванию препаратов при контакте с водной средой [13, 14].

Отмечено полное отсутствие активности де-ламанида даже в контрольных образцах без смены буфера. Деламанид является производным нитроимидазола с выраженной гидрофобностью, что, вероятно, приводит к его прочной сорбции на полимерной матрице без последующего высвобождения в водную среду. Альтернативной гипотезой является химическая деградация препарата при контакте с материалом имплантата, однако данное предположение требует дополнительного изучения методами аналитической химии [15].

Сравнительный анализ исследованных систем указывает на больший потенциал имплантатов, содержащих наночастицы серебра, для их дальнейшего изучения в контексте хирургического лечения туберкулеза легких.

Настоящее исследование носит пилотный характер и имеет ряд ограничений. Так, использовался только 1 референс-штамм M. tuberculosis H37Rv, а условия высвобождения препаратов in vitro не в полной мере моделируют фармакокинетику в тканях легкого.

Перспективными направлениями дальнейших исследований являются создание композиционных материалов с барьерными слоями, замедляющими диффузию активных веществ; микроинкапсуляция препаратов перед импрегнацией; химическая модификация поверхности пор для усиления связывания с лекарственными веществами; разработка структур типа «ядро – оболочка» с различной кинетикой деградации слоев.

Заключение. Проведенное нами исследование позволило оценить антимикобактериальную активность биорезорбируемых имплантатов на основе ПЛА, ПКЛ и хитозана, насыщенных наночастицами серебра и ПТП. Имплантаты, импрегнированные наночастицами серебра, обладают более пролонгированным действием в отношении M. tuberculosis . Использование для насыщения линезолида, бедак-вилина, моксифлоксацина, капреомицина, изониазида, амикацина приводит к быстрому созданию бактерицидной концентрации вне имплантата в течение первых 3 сут, что крайне важно для предотвращения специфических осложнений, связанных с прогрессированием туберкулеза в ранний послеоперационный период.

Полученные результаты показали принципиальные различия в антимикобактериальной активности исследованных систем и позволили обозначить направления дальнейшего поиска, включающие оптимизацию концентрации наночастиц серебра, разработку структур с барьерными слоями для пролонгированного высвобождения ПТП, а также изучение комбинированного применения наночастиц серебра с ПТП.