Оценка ингибирующей активности штаммов Bacillus subtilis 26 D и Bacillus thuringiensis var. Thuringiensis при прорастании семян Trifolium pratense L.

Спорообразующие бактерии рода Bacillus синтезируют большое количество физиологически активных веществ, среди которых особое значение в изучении отводится стимуляторам и ингибиторам роста и развития растений. Так, эндофитный штамм Bac. subtilis 26 D продуцирует вещества, оказывающие сильное ингибирующее действие на прорастающие семена Triticum sp. L ., а среди энтомопатогенных культур Bac. thuringiensis, естественных регуляторов численности насекомых, 92% из 143-х изучавшихся шта-мов угнетают рост ее колеоптелей [7; 8].

Цель исследования: оценить фитотоксичность штаммов Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis при прорастании семян Trifolium pratense L.

Trifolium pratense L. широко распространенный вид растений на территории Северного При-охотья. Вид играет огромную роль в образовании растительного покрова: является распространенным медоносом, применяется как декоративная и пастбищная культура, используется для рекультивации нарушенных почв.

Для достижения поставленной цели устанавливалась всхожесть семян Trifolium pratense L. и определялась сырая масса проросших семян в контроле и культуральных средах с бациллами.

Материал и методика исследования. В качестве материала использовались штаммы Bac. subtilis 26 D, Bac. thuringiensis var. thuringiensis и семена Trifolium pratense L . (рис. 1).

Ингибирующая активность штаммов оценивалась путем определения сырой массы проросших семян Trifolium pratense L. и их всхожести. Под

всхожестью понимается количество появившихся всходов, выраженное в процентах к количеству высеянных семян [1; 3; 5; 6].

Опыты проводились в 4-х вариантах с 5-ти кратной повторностью. Методика постановки опыта заключалась в следующем. В первом контрольном варианте опыта семена Trifolium pratense L. по 50 шт. в каждой из 5-ти чашек Петри (всего 250 семян) проращивались четверо суток в термостате при t=+25C° на дистиллированной воде (5 мл. на одну чашку Петри). Во втором контрольном варианте семена проращивались на жидкой питательной среде (ПВМБ - протеино-витаминно-минеральный бульон) так же четверо суток в термостате при той же температуре. В третьем и четвертом вариантах в течении двух суток штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis соответственно культивировались в термостате при t=+25C° на жидких питательных средах (ПВМБ, 5 мл. на чашку Петри). После этого в чашки Петри с культуральной жидкостью добавляли семена Trifolium pratense L. по 50 шт. в каждую из 5-ти чашек Петри. Засеянные чашки семенами помещались в термостат с t=+25C° еще на четверо суток для их проращивания.

По истечении указанного времени во всех чашках Петри подсчитывали число проросших семян и измеряли их вес на электронных весах серии “Highland” Adam НСВ 1002. Полученные результаты сравнивали с контролем. Обработка данных производилась с помощью программ” Microsoft Office Excel 2007" и “Statistica 6”.

Результаты и их обсуждение. Средние арифметические результаты, полученные во всех вариантах опыта, для установленного уровня значимости Р=0,05 оказались достоверны (все t>t_таб. = 2,78) (табл. 1).

• а)                                                          б)

Рис. 1. 7-ми суточные колонии бактерий на протеино-витаминно-минеральном агаре (ПВМА): а – Bacillus subtilis 26 D; б – Bac. thuringiensis var. thuringiensis

Таблица 1 . Всхожесть и сырая масса проросших семян в контрольных и культуральных средах с Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis на 4-ые сутки

Вариант опыта	Всхожесть			Сырая масса проросших семян
	М х [М х ±2,78•m] Р=0,05, (%)	m, (%)	t	М х [М х ±2,78•m]Р=0,05, (г)	m, (г)	t
1	56,4 [43,9; 68,9]	±4,5	12,5	0,59 [0,46; 0,73]	±0,05	11,8
2	55,2 [46,8; 63,6]	±3,0	18,4	0,55[0,44; 0,67]	±0,04	13,8
3	51,6 [36,5; 66,7]	±5,4	9,6	0,43[0,21; 0,65]	±0,08	5,4
4	48,8 [37,1; 60,5]	±4,2	11,6	0,35 [0,23; 0,46]	±0,04	8,8

Примечание: М х - средняя арифметическая выборки; [М х + 2,78^m] - доверительный интервал для М х ; m – стандартная ошибка средней; t – достоверность средней арифметической

Всхожесть семян в контрольных средах в первом и во втором вариантах была практически одинаковой: 56,4 + 4,5% и 55,2 + 3,0% соответственно. Разница между вариантами составила 1,2 + 5,4%. Сырая масса проросших семян в первом варианте: 0,59 + 0,05 г и 0,55 + 0,04 г во втором, с разницей 0,04 + 0,06 г или 6,8% (табл. 1, 2).

Вышеприведенные результаты показывают, что жидкая питательная среда в контроле во втором варианте в сравнении с первым для семян не токсична. Так как в опытах с бациллами использовались жидкие питательные среды, то полученные результаты в третьем варианте в дальнейшем сравнивались с контролем во втором варианте.

Всхожесть семян в культуральных средах с Bac. subtilis 26 D в третьем и Bac. thuringiensis var. thuringiensis в четвертом варианте составила 51,6 + 5,4% и 48,8 + 4,2% соответственно (рис. 2).

Разница между вторым контрольным и третьим вариантом составила 3,6 + 6,2%, а между вторым и четвертым - 6,4 + 5,2% (табл. 2). Сырая масса проросших семян в третьем варианте с Bac.

subtilis 26 D составила 0,43 + 0,08 г, а в контроле во втором варианте - 0,55 + 0,04 г (рис. 3). Разница между вариантами - 0,12 + 0,09 г (21,8%).

Сырая масса проросших семян в третьем варианте с Bac. thuringiensis var. thuringiensis составила 0,35 + 0,04 г, а в контроле во втором варианте - 0,55 + 0,04 г. Разница между вариантами -0,20 + 0,06 г или 36,4%.

Имеющиеся между вариантами различия проверялись на достоверность статистическими методами анализа с использованием параметрического t - критерия Стьюдента и непараметрического U - критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [1; 2; 4; 9; 10; 11, 12].

При проверке статистических гипотез использовались два понятия: Н0 - это нулевая гипотеза о сходстве или отсутствии различий в вариантах и Н1 - альтернативная гипотеза о имеющихся различиях в вариантах опыта.

Формулировка гипотез. Всхожесть семян: 1) Н₀: разница между вариантами недостоверна, если U_эмп >  U _kp , или Р_эмп>0,05, илиt_факт <  ^аб .

5 CM

о £ 40

о 30

СО

12  3  4

Варианты опыта

Условные обозначения : □ - средняя арифметическая, (М^; I - дверительный интервал для М_х, [М_х ±2,78*т].

Рис. 2. Всхожесть семян Trifolium pratenseL. в контроле и с бациллами

Штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis не влияют на всхожесть семян Trifolium pratense L.. 2) Н₁: разница между вариантами достоверна, если и э _мп <  U_K p , или Р э _мп<0,05, или t ф _акт >  t_Iа6. Штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis влияют на всхожесть семян Trifolium pratense L.

Сырая масса проросших семян: 1) Н₀: разница между вариантами недостоверна, если U_эмп. >  U _kp , или Р э _мп >0,05, или t ф _акт <  t_та6 Штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis var. thuringiensis не ингибируют прорастающие семяна Trifolium pratense L. 2) Н₁: разница между вариантами достоверна, если и эмп <  U_k p , или Р эмп <0,05, или t ф _акт >  t_таб. Штаммы Bac. subtilis 26 D и Bac. thuringiensis

Варианты опыта

Условные обозначения : □ - средняя арифметическая, (М^; | - дверительный интервал дляМ_х, [М_х±2,78*т].

Рис. 3. Сырая масса проросших семян Trifolium pratense L. в контроле и с бациллами var. thuringiensis ингибируют прорастание семян Trifolium pratense L.

Таким образом, в эксперименте можно констатировать достоверные различия между средними арифметическими в вариантах опыта, если и эмп <  Up или Р_эмп<0,05, или t ф _акт >  t_та6 (табл. 2).

Разница между контрольным вторым и третьим вариантом с Bac. subtilis 26 D по всхожести и сырой массе проросших семян Trifolium pratense L. оказалась не достоверна. Bac. thuringiensis var. thuringiensis также не повлиял на всхожесть, т.е. нулевая гипотеза осталась не опровергнутой (табл. 2).

Альтернативная гипотеза была принята лишь в четвертом варианте по сравнению с кон-

Таблица 2. Оценка достоверности раличий между средними арифметическими в вариантах опыта

Статистические показатели	Варианты опыта
	Всхожесть			Сырая масса проросших семян
	1-2	2-3	2-4	1-2	2-3	2-4
U эмп. (n 1 = 5; n 2 = 5)	12,0	9,5	6,5	7,5	6,0	1,0
р эмп.	0,917	0,531	0,210	0,296	0,175	0,016
Суммарный ранг группы 1	28,0	30,5	33,5	32,5	34,0	39,0
Суммарный ранг группы 2	27,0	24,5	21,5	22,5	21,0	16,0
и эмп. < U kp. (U kp. =4; Р=0,05)	нет	нет	нет	нет	нет	да
Р эмп. <0,05	нет	нет	нет	нет	нет	да
d,(%, г)	1,2	3,6	6,4	0,04	0,12	0,20
m d ,(%, г)	±5,4	±6,2	±5,2	±0,06	±0,09	±0,06
tфак т.	0,22	0,58	1,23	0,67	1,33	3,33
t факт. >  tra6. (t ma6 = 2,31; Р=0,05)	нет	нет	нет	нет	нет	да

Примечание: U – критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (эмпирический и критический); P – уровень значимости (эмпирический); d – разница между средними арифметическими в вариантах; m d – ошибка разности; t_факт.и t_таб. – критерий существенности фактический и табличный по Стъюденту, при этом число степеней свободы равно: v = n₁+n₂ - 2; v = 5+5-2=8; t_таб. = 2,31.

тролем, на что указывают различия в показателях сырой массе проросших семян Trifolium pratense L. .

Выводы: Проведенные исследования позволяют достоверно утверждать, что штамм Bac. subtilis 26 D не фитотоксичен. Продукты его метаболизма не угнетают развитие семян Trifolium pratense L. и не влияют на их всхожесть. Штамм Bac. thuringiensis var. thuringiensis также не влияет на всхожесть семян Trifolium pratense L. , однако ингибирует их дальнейший рост и развитие, что свидетельствует о фитотоксичности штамма.