Оценка изменений ядерно-ядрышкового аппарата и выживаемости клеток сперматогенного эпителия при цинковой интоксикации

Материалы и методы исследований . Работа проведена на 40 белых беспородных мышах – самцах массой 19–21 г в двухмесячном возрасте, по 10 животных в каждой группе. В качестве модельного ксенобиотика использовался хлорид цинка в дозе 20 мг/кг массы тела. Полиморфизм ядрышек анализировали через 24 часа. Животным 2-й и 3-й групп вводили ксенобиотик в той же дозе ежедневно в течение 5 и 10 дней соответственно, с последующим аналогичным исследованием. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Забой животных осуществлялся путем цервикальной дислокации спинного мозга в шейном отделе.

Исследование изменений активности ядрышкового аппарата клеток сперматогенного эпителия проводили путем фиксированния в течение 7 минут в метаноле мазков сперматогенного эпителия и обработки их следующим раствором: смешивали 2 г желатина, растворенного в 50 мл дистиллированной воды, и 0,5 мл 1%-й муравьиной кислоты, в эту смесь добавляли 12 г нитрата серебра (Уральский завод химреактивов). Затем заливали мазки этим раствором и помещали в термостат при температуре 37-38 ° С на 20 минут, после чего стекла промывали дистиллированной водой и высушивали [8]. После окраски клетки классифицировали по форме ядра (на 200 клеток сперматогенного эпителия, увеличение х 1000) по видам:

I – клетки без морфологических повреждений;

II – клетки с морфологическими признаками деградации хроматина.

В клетках определяли 2 типа ядрышек:

• 1    – крупные (2–4 мкм в диаметре): компактные и нуклеолонемные с высокой функциональной активностью; 2 – мелкие (до 2 мкм в диаметре): плотные фибриллярные с низкой функциональной активностью [7]. Диаметр ядрышек определяли с помощью окуляра-микрометра МОВ-1 х 5.

Жизнеспособность клеток сперматогенного эпителия определяли при помощи теста с витальным красителем (трипановым синим). Равные объемы (по 20 мкл) суспензии клеток сперматогенного эпителия и 0,1%-го трипанового синего («Serva») смешивали и помещали в камеру Горяева. Микроскопировали с помощью микроскопа «Биомед 1», увеличение ×300. По морфологии цитоплазматической мембраны сперматозоиды дифференцировали на два типа:

жизнеспособные клетки (с прозрачной цитоплазмой) и нежизнеспособные клетки (с прозрачной цитоплазмой фиолетового цвета).

Клетки подсчитывали в больших квадратах. Пересчитывали клетки по стандартной формуле: х = а×5, полученной в результате преобразования: х = (а×250×2)/100, где х – общее количество клеток в 1 мкл жидкости;

• 2    – коэффициент разведения;

• а    – число клеток в подсчитанных квадратах;

• 100    – число сосчитанных больших квадратов;

250 – множитель, приводящий результат к объему в 1 мкл жидкости [7].

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t- критерия Стьюдента [3]. Различия считали значимыми, если вероятность случайности не превышала 5% (Р < 0,05).

Результаты и их обсуждение . В ходе наших экспериментов установлено, что при острой затравке животных хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг через 24 часа отмечалось достоверное увеличение числа клеток с деградацией хроматина. Количество ядрышек 1-го и 2-го типов в клетках без видимых морфологических повреждений снизилось и составило 88,28 ± 0,61% (Р < 0,001) и 81,62 ± 0,35% (Р < 0,001) по сравнению с контролем 97,98 ± 0,27% и 94,76 ± 0,46% соответственно. Вместе с тем в клетках сперматогенного эпителия с деградацией хроматина количество крупных и мелких ядрышек увеличилось и составило 11,72 ± 0,6% (Р < 0,001) и 18,38 ± 0,35% (Р < 0,001) по сравнению с контролем соответственно. При пятисуточном введении ксенобиотика наблюдалась тенденция к возрастанию количества клеток с деградацией хроматина в 14 раз. При этом в клетках без видимых морфологических повреждений количество ядрышек 1-го и 2-го типов снижалось до 86,40 ± 0,27% (Р < 0,001) и 67,0 ± 0,1% (Р < 0,001) по сравнению с контролем 97,98 ± 0,27% и 94,76 ± 0,4% соответственно. В клетках с деградацией хроматина в ядре количество ядрышек 1-го типа возросло в 6,7 раза, а ядрышек 2-го типа – в 6,3 раза по сравнению с контрольным уровнем. Десятисуточное введение хлорида цинка привело к возрастанию количества клеток с деградацией хроматина в ядре и составило 35,02 ± 0,34% (Р < 0,001) и 1,76 ± 0,23% в опыте и контроле соответственно и снижению количества клеток без видимых морфологических повреждений - 64,98 ± 0,34% (Р < 0,001) и 98,24 ± 0,24% в опыте и контроле соответственно. Количество крупных и мелких ядрышек в клетках без видимых морфологических повреждений снизилось и составило 83,56 ± 0,29% (Р < 0,001) и 61,64 ± 0,52% (Р < 0,001) соответственно, тогда как в клетках с признаками деградации хроматина количество крупных и мелких ядрышек достоверно возросло в 8,4 и в 7,3 раза соответственно (рис. 1, 2).

Рис. 1. Изменение ядерного материала в клетках сперматогенного эпителия мышей при внутрибрюшинном введении хлорида цинка в дозе 20 мг/кг

Рис. 2. Относительное количество ядрышек 1 типа (А) и 2 типа (Б) в клетках без морфологических признаков повреждения ядер (I) и в клетках с деградацией хроматина (II)

Таким образом, воздействие хлорида цинка проявляется в повреждении нуклеолярного аппарата клеток сперматогенного эпителия по типу снижения транскрипционной активности в прямой зависимости «время-эффект».

При исследовании жизнеспособности клеток сперматогенного эпителия мышей установлено, что при затравке животных хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг через 24 часа и 5 суток отмечалось недостоверное снижение числа живых сперматозоидов до 89±0,57 и 83,75±2,41 соответственно по сравнению с контролем (88,25±2,56), а при 10-дневной затравке животных ксенобиотиком количество жизнеспособных половых клеток достоверно снижалось до 83,75±2,41 (Р < 0,01) (рис. 3).

контроль опыт

Рис. 3. Динамика процессов выживаемости половых клеток мышей при действии хлорида цинка в дозе 20 мг/кг. По оси абсцисс: продолжительность воздействия хлорида цинка в днях

Выводы. Таким образом, интоксикация хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг приводит к значительному снижению транскрипционной активности ядрышкового аппарата клеток ткани семенников, снижая их жизнеспособность, с проявлением зависимости «время-эффект».