Оценка изменений в показателях спермограммы крыс при совместном использовании липосомальных цитостатиков и Ксимедона в эксперименте

В литературе описывается метод заключения цитостатиков в липосомы с целью удлинения времени их циркуляции в кровотоке, снижения скорости их высвобождения, отсутствия времени пикового роста концентрации свободного препарата в крови, снижения их токсичности [2]. В связи с особенностями механизма кровоснабжения опухоли, называемого «enhanced permeability and retention», обеспечивается целевая доставка цитостатиков в опухолевую ткань. В то же время заключенные в липосомы цитостатики поглощаются клетками ретикулоэндотелиальной системы (купферовские клетки печени, альвеолярные макрофаги, ретикулярные клетки селезенки и красного костного мозга и т.д.), где цитостатики оказывают токсический эффект на здоровые ткани [2].

Вместе с тем имеются сведения о повышении концентрации липосомального цитостатика в семенниках по сравнению со свободной формой препарата, что делает его более гонадотоксичным в связи с активацией здесь окислительного стресса [3; 4].

Главным патогенетически обоснованным способом решения данной проблемы является применение антиоксидантов. Одним из них является ксимедон - препарат пиримидинового ряда, активный участник системы антиоксидантной защиты, а также иммуномодулятор, стимулятор эндогенного дыхания, обменных процессов [5; 6]. При этом нет единого мнения об эффективности использования антиоксидантов, в частности – ксимедона, в качестве коррекции основного лечения.

Цель работы: оценить изменения параметров спермограммы крыс с карциномой Уокер-256 при использовании липосомальной комбинации доксорубицина и циклофосфамида в сочетании с ксимедоном в свободной и липосомальной формах.

Материал и методы исследования. Эксперимент проводился на 64 крысах-самцах «Wistar» с массой тела 120-230 г. Животные наблюдались в виварии ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва». Клетки опухоли Уокер-256 (W-256) вводили в среднюю треть хвоста подкожно (1 млн клеток, разведенных в растворе Хэнкса). Комбинацию свободных и липосомальных доксорубицина в дозе 4 мг/кг и циклофосфамида в дозе 45 мг/кг вводили однократно внутривенно на 11-е сутки после введения опухолевых клеток (группы W+ДР+ЦФ и W+ДР+ЦФ л).

Для создания липосом использовали роторный испаритель Heidolph (Германия) и экструдер LIPEX (Канада). Очистку липосом от свободных фракций осуществляли с помощью диализа в атмосфере инертного газа.

Свободный и липосомальный ксимедон в дозах 50 и 100 мг/кг вводили внутривенно 5 суток, начиная со дня использования цитостатиков (группы W+ДР+ЦФ л + ксим 50, W+ДР+ЦФ л + ксим 50 л, W+ДР+ЦФ л + ксим 100, W+ДР+ЦФ л + ксим 100 л).

К исходу 3-х и 7-х суток после химиотерапии у 5-7 крыс из каждой группы, выведенных из эксперимента под общей анестезией тиопенталом натрия, изучали суспензию, получаемую после продольного разреза эпидидимиса в 2 мл изотонического хлорида натрия и последующего дозированного его перемешивания в течение 2 минут резиновой трубкой при комнатной температуре.

Количество сперматозоидов с оценкой их подвижности считали в камере Горяева. Подсчитывали прогрессивно-подвижные, непрогрессивно-подвижные и неподвижные сперматозоиды. Для оценки жизнеспособности сперматозоидов на предметное стекло наносили каплю суспензии, прибавляли 1%-й раствор эозина, перемешивали, накрывали покровным стеклом и через 30 сек оценивали результаты в микроскопе.

Статистическую обработку результатов проводили, используя Т -критерий Стьюдента. Различия считали достоверными, если p <0,05.

Результаты. На 3-и сутки после проведенной химиотерапии доксорубицином и циклофосфамидом их липосомальная форма показала больший гонадотоксический эффект по сравнению со свободной. Показатель прогрессивно-подвижных сперматозоидов здесь был в 3,4 раза меньше относительно группы с применением цитостатиков в свободной форме. Количество неподвижных спермиев в группе W+ДР+ЦФ л, наоборот, увеличивалось в 1,5 раза по отношению к группе W+ДР+ЦФ (рис. 1).

в 1 мл, х 106

#

*

Общее количество

■ Прогрессивно-подвижные

• ■    Непрогрессивно-подвижные ■ Неподвижные

Рис. 1. Влияние свободной и липосомальной форм ксимедона на подвижность сперматозоидов крыс с карциномой Уокер-256 при применении липосомальных доксорубицина и циклофосфамида (3-и сутки после химиотерапии).

Относительно прогрессивно-подвижных сперматозоидов группы с использованием липосомального ксимедона имели достоверные различия с группой с применением липосомальных цитостатиков без коррекции. На фоне липосомального ксимедона в дозе 50 мг/кг содержание прогрессивно-подвижных сперматозоидов оказалось выше в 3,6 раза, а в дозе 100 мг/кг - в 2,2 раза (р <0,05). Также различия были зафиксированы в группах W+ДР+ЦФл+ксим 100 и W+ДР+ЦФл+ксим 100 л. Здесь количество прогрессивно-подвижных сперматозоидов было в 2,4 раза больше, чем у крыс с введением цитостатиков без коррекции. Число прогрессивно-подвижных клеток в группе с использованием свободного ксимедона в дозе 50 мг/кг не отличалось от такового в группе W+ДР+ЦФ л. Таким образом, липосомальная форма ксимедона в дозе 50 мг/кг, в отличие от его свободной формы, способствует увеличению числа прогрессивно-подвижных сперматозоидов и является более эффективной. Ксимедон в дозе 100 мг/кг в обеих формах одинаково эффективно способствует росту числа прогрессивно-подвижных спермиев.

Со стороны непрогрессивно-подвижных и неподвижных клеток достоверных различий у групп с применением ксимедона по отношению к группе с химиотерапией липосомальными цитостатиками без коррекции зафиксировано не было.

На 7-е сутки после химиотерапии, аналогично 3 суткам, больший гонадотоксический эффект показала группа с применением липосомальных форм цитостатиков. Показатели непрогрессивно-подвижных и неподвижных сперматозоидов здесь увеличивались в 1,7 и 1,4 раза соответственно по сравнению с группой W+ДР+ЦФ (р <0,05, рис. 2).

Общее количество

■ Прогрессивно-подвижные

• ■    Непрогрессивно-подвижные ■ Неподвижные

Рис. 2. Влияние свободной и липосомальной форм ксимедона на подвижность сперматозоидов крыс с карциномой Уокер-256 при применении липосомальных доксорубицина и циклофосфамида (7-е сутки после химиотерапии).

Положительный результат в виде нарастания численности прогрессивно-подвижных сперматозоидов отмечался на фоне введения ксимедона в дозе 100 мг/кг в свободной и липосомальной форме. Эти изменения в обеих группах оказались сопоставимы. У крыс с коррекцией ксимедоном в липосомах количество прогрессивно-подвижных спермиев было в 2,7, а в свободной форме - в 2,5 раза больше, чем в группе без коррекции (р <0,05). Коррекция ксимедоном в дозе 50 мг/кг в обеих формах оказалась неэффективной.

Коррекция липосомальным и свободным ксимедоном в дозах 50 и 100 мг/кг не приводила к достоверным различиям в числе непрогрессивно-подвижных сперматозоидов относительно группы W+ДР+ЦФ л.

Коррекция лечения ксимедоном положительно влияла на жизнеспособность сперматозоидов во всех группах (рис. 3).

Рис. 3. Влияние свободной и липосомальной форм ксимедона на жизнеспособность сперматозоидов крыс с карциномой Уокер-256 при применении липосомальных доксорубицина и циклофосфамида на 3-и и 7-е сутки после химиотерапии.

Примечания к рисункам: * - достоверные различия с интактными крысами; v - достоверные различия с W-256; # - достоверные различия с W+ДР+ЦФ; @ - достоверные различия с W+ДР+ЦФ л

На 3-и сутки жизнеспособность спермиев у крыс, получавших ксимедон в липосомах в дозе 50 мг/кг, была больше в 2,2 раза по сравнению с группой без коррекции, а в дозе 100 мг/кг - в 2 раза (р <0,05).

На 7-е сутки достоверных различий касательно жизнеспособности сперматозоидов между группами не было выявлено, однако, отмечалась тенденция к ее повышению, особенно в группе с коррекцией свободным ксимедоном в дозе 100 мг/кг.

Выводы .

• 1.    Химиотерапия липосомальными доксорубицином и циклофосфамидом показала большее токсическое влияние на подвижность сперматозоидов по сравнению с их свободными формами.

• 2.    На 3-и сутки после химиотерапии липосомальный ксимедон в дозе 50 мг/кг, в отличие от его свободной формы, достоверно увеличивал число прогрессивно-подвижных сперматозоидов. Ксимедон в дозе 100 мг/кг в обеих формах также одинаково эффективно способствовал росту числа этих клеток.

• 3.    На 7-е сутки после химиотерапии доза ксимедон 100 мг/кг оказалась более эффективной, чем 50 мг/кг, причем липосомальная форма не показала своего преимущества перед свободной.

• 4.    Липосомальный ксимедон в дозах 50 и 100 мг/кг в среднем в 2 раза увеличивал жизнеспособность сперматозоидов на 3-и сутки после химиотерапии, однако на 7-е сутки на фоне свободной формы ксимедона в дозе 100 мг/кг отмечалась лишь тенденция к ее увеличению.