Оценка эффективности криоконсервации гамет и эмбрионов человека в программах вспомогательных репродуктивных технологий

Введение. Развитие вспомогательных репродуктивных технологий (далее - ВРТ) требует высокого уровня клеточных технологий на эмбриологическом этапе. Криоконсервация гамет и эмбрионов является клинически значимым методом повышения кумулятивной частоты наступления беременности [1]. При проведении стандартной процедуры стимуляции овуляции и оплодотворения ооцитов in vitro более чем в 60% случаев после выполнения переноса остаются эмбрионы пригодные для замораживания. В результате криоконсервация создает возможность продолжения лечения в случае отсутствия беременности в стимулированном цикле. Замороженные эмбрионы могут быть оттаяны и перенесены в матку пациентки в последующих циклах, не требующих использования дорогостоящих гормональных схем стимуляции суперовуляции [2]. Другим явным преимуществом криоконсервации безусловно является возможность отмены в стимулированном цикле переноса эмбрионов в случае развития у пациентки синдрома гиперстимуляции тяжелой степени, а также при возникновении факторов риска нарушения имплантации (кровотечение, недостаточность секреторной трансформации и полипы эндометрия, а также экстремально трудный перенос эмбрионов) [3].

Цель исследования - сравнить эффективность применения нативных и замороженных гамет в циклах вспомогательных репродуктивных технологий и оценить влияние типа носителя для замораживания и хранения эмбрионов на результаты криопрограмм и криопротоколов.

Материалы и методы исследования. В работе были использованы ооциты, сперматозоиды и эмбрионы человека, исследование которых проведено с соблюдением международных этико-правовых норм обращения с эмбрионами человека [ст. 18 Конвенции Совета Европы о защите прав человека и достоинства человеческого существа при использовании достижений биологии и медицины, 1997]. Изучение гамет и эмбрионов было проведено в рамках циклов экстракорпорального оплодотворения на базе эмбриологических лабораторий ЗАО «Медицинская компания ИДК». Использование в научных исследованиях половых клеток и эмбрионов человека было разрешено этическим комитетом Самарского государственного медицинского университета Минздрава России. Гаметы и эмбрионы были идентифицированы под контролем стереомикроскопа (Nikon, Япония). Для инкубации в условиях 5% O 2 использованы инкубаторы СООК (Австралия). Для культивирования эмбрионов до 5-6-х суток эмбрионального развития были использованы среды Vitrolife (Швеция). Для витрификации ооцитов использованы среды и протоколы Kitozato (Япония) и открытые виды носителей CryoTop (Япония). Для витрификации сперматозоидов использованы среды FertiPro (Франция) и носители закрытого типа - соломины 0,25 (Франция). Для витрификации эмбрионов были использованы среды Irvine Scientific (США) и носители открытого CryoTop (Япония) и закрытого CryoTip (США) типов. Бластоцисты 5-6-х суток культивирования оценивали по международной классификации [4].

Статистическую обработку результатов выполняли на компьютере в среде статистических вычислений R (R v.3.5.3, RStudio v.1.1.463), первичный ввод данных производили с помощью электронных таблиц MS Excel. Использовались методы описательной статистики, тесты для сравнения пропорций, в том числе точный биноминальный для малых выборок и одновыборочный тест пропорций с коррекцией непрерывности для больших выборок.

Результаты исследования и обсуждение. Одной из основных характеристик, определяющих качество сперматозоидов и их криотолерантность, является кинетическая характеристика. Оценивалась подвижность сперматозоидов до и после процедур замораживания и размораживания. Проанализировано 120 образцов спермы здоровых мужчин (доноров спермы). В 100 случаях (83%) снижение подвижности после размораживания составляло от 67% до 84% от исходных значений показателя. Исследование показало, что в 25% случаев имела место низкая криотолерантность сперматозоидов. В дальнейшем отобранные образцы спермы были использованы для оплодотворения в программах ВРТ. Частота наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в яйцеклетку с использование криоконсервированных донорских сперматозоидов составила 42%. Для оценки влияния витрификации мы сравнили эффективность использования нативных и замороженных ооцитов (таблица 1).

Таблица 1 Основные показатели качества программ ВРТ при использовании нативных (свежих) и витрифицированных (замороженных) ооцитов

Из приведенных данных следует, что показатели группы витрифицированных ооцитов по сравнению с группой нативных ооцитов были несколько ниже. Это может быть следствием нарушением восстановления веретена деления, неполного восстановления органелл ооцита после размораживания. Однако, показатели частоты наступления беременности при использовании свежих и замороженных ооцитов статистически не различаются, что позволяет использовать технологию криоконсервации ооцитов на эмбриологическом этапе программ ВРТ без снижения шансов на получение беременности.

Важным элементом процесса замораживания является носитель, в котором находится образец в процессе криоконсервации и последующего хранения [5]. Носители для криоконсервации ооцитов и эмбрионов должны обеспечивать надежную сохранность эмбрионов во время охлаждения, хранения и нагревания. Носители делятся на две группы – открытые и закрытые. В случае, когда носитель открытого типа – капля криопротекторного раствора с эмбрионом непосредственно контактирует с жидким азотом (например, CryoTop, Япония). В носителе закрытого типа (например, CryoTip, США) криопротекторный раствор не контактирует с жидким азотом и охлаждение происходит через стенку защитного чехла. Как у открытого, так и у закрытого носителя имеется защитный чехол, который предотвращает механическое повреждение замороженного эмбриона.

Для оценки эффективности разных носителей рассчитывали следующие показатели: выживаемость, средний балл эмбриона(ов) на перенос, среднее количество эмбрионов на перенос, частота наступления беременности, частота родов и потери (таблица 2).

Таблица 2

Основные критерии эффективности криопрограмм при использовании эмбрионов, витрифицированных в закрытых и открытых типах носителей

За 2015-2016 годы на рассматриваемых видах носителей было разморожено 1289 эмбрионов. Выживаемость эмбрионов на закрытых носителях составила 84,8%, на открытых - 95,1%, и эта разница статистически значима (p<0,0001). Средний балл эмбрионов на перенос в I группе составил 3,9, во II группе – 4,1. Среднее количество эмбрионов на перенос 1,2 и 1,3, соответственно. Частота наступления беременности статистически значимо отличалась (p<0,0001) и составила 39,5% (I группа) и 44,2% (II группа). Частота родов на клиническую беременность с учетом известных исходов составила в I группе 72,7%, во II группе 67,3%, потери составили 27,3% и 24,3%, соответственно. Показатели частоты родов и потерь статистически значимо различались. В целом, результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о более высоком уровне выживаемости эмбрионов при использовании открытых носителей при криоконсервации.

Заключение. Таким образом, витрификация гамет и эмбрионов позволяет сохранить качество и нормальный морфологический и физиологический статус клеток и дает возможность их использования в будущем. Это позволяет применять данную технологию наравне с нативным материалом без снижения качества и эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий. При этом открытые носители для замораживания и хранения эмбрионов демонстрируют более высокие показатели эффективности криопрограмм по сравнению с закрытыми. Клинические показатели

(показатели частоты наступления клинической беременности, родов и потерь беременности), которые напрямую зависят от уровня выживаемости, также демонстрируют статистически значимую разницу в пользу использования открытых носителей в эмбриологической практике.

Авторы сообщают об отсутствии каких-либо конфликтов интересов при планировании, выполнении, финансировании и использовании результатов настоящего исследования.