Оценка эффективности ЛАГ-специфической терапии, включающей селексипаг, у пациентов с идиопатической легочной гипертензией по данным комплексного обследования с использованием метода спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния

Данная статья распространяется на условиях «открытого доступа», в соответствии с лицензией CC BY-NC-SA 4.0 («Attribution-NonCommercial-ShareAlike» / «Атрибуция-Не-коммерчески-Сохранение Условий» 4.0), которая разрешает неограниченное некоммерческое использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника. Чтобы ознакомиться с полными условиями данной лицензии на русском языке, посетите сайт: by-nc-sa/4.0/

УДК 616.131

Легочная артериальная гипертензия (ЛАГ) – редкое заболевание сердечно-сосудистой системы прогрессирующего течения с неблагоприятным прогнозом. По данным зарубежных регистров, идиопатическая легочная гипертензия (ИЛГ) является наиболее распространённой формой патологии и встречается примерно у половины пациентов с ЛАГ [1]. В настоящее время доказано, что патогенез ИЛГ является мультифакторным и включает ремоделирование артерий малого круга кровообращения, а также нарушение биохимических и биофизических процессов в различных типах клеток. Кроме того, важную роль в патогенезе заболевания играет гипоксия, обусловленная конформационными изменениями в гемоглобине (Гб), которые формируются в результате вышеупомянутых морфологических и транспортных изменений в сосудистой системе [2]. Диагностика ИЛГ основана на комплексном лабораторно-инструментальном обследовании с определением гемодинамических данных пациента [3].

Спектроскопия резонансного комбинационного рассеяния (КР-спектроскопия) — это метод, который использует неупругое рассеяние света для получения информации о химическом составе и конформации молекул, что важно для оценки кис-лород-транспортной функции крови пациентов. Гб составляет более 95% сухого веса эритроцитов и является удобным объектом для применения Раман-рассеяния (комбинационное рассеяние, КР) при исследовании конформации как глобина, так и гема. В предыдущих работах нами было продемонстрировано успешное применение КР-спектроскопии для исследования конформации Гб и оценки кислород-транспортной функции у пациентов с ИЛГ [2]. Анализ КР-спектра гема Гб позволяет исследовать изменения конформации макропорфиринового цикла при взаимодействии атома железа с лигандами, что важно для оценки кислород-транспортной функции эритроцитов крови.

Назначение ЛАГ-специфической терапии на ранних этапах заболевания существенно повышает выживаемость и качество жизни пациентов. В широкомасштабном рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании GRIPHON применение селексипага – первого препарата из класса агонистов простациклиновых рецепторов для перорального приема – замедляло прогрессирование ЛАГ. При этом эффективность препарата не зависела от этиологии ЛАГ, а также режима моно- или комбинированной ЛАГ-специфической терапии [4].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Всего в исследование включено 14 пациентов с ИЛГ, которые были госпитализированы для обследования и лечения в отдел легочной гипертензии и заболеваний сердца ФГБУ «НМИЦ кардиологии им. ак. Е.И. Чазова» Минздрава России в период с 01.01.2020 г. по 01.01.2023 г. [5]. Диагноз ИЛГ устанавливался в соответствие с алгоритмом, предложенным в Евразийских рекомендациях по диагностике и лечению ЛГ (2019 г.) [3].

Критериями включения были: возраст старше 18 лет; верифицированный диагноз ИЛГ; прием стабильной ЛАГ-специфической терапии на протяжении не менее 3 мес., за исключением илопроста; подписанное информированное согласие на участие в исследовании.

Критериями невключения явились: ЛАГ установленной этиологии; легочная гипертензия, обусловленная заболеваниями легких и/или патологией левых отделов сердца; хроническая тромбоэмболическая легочная гипертензия; ишемическая болезнь сердца; тяжелые нарушения сердечного ритма; цереброваскулярные заболевания (например, преходящее нарушение мозгового кровообращения, инсульт) в течение предшествующих 6 месяцев; декомпенсация сердечной недостаточности; тяжелая сопутствующая патология, препятствующая участию пациента в исследовании (печеночная недостаточность средней и тяжелой степени тяжести, ХПН 4-5 ст.; отказ от проведения катетеризации правых отделов сердца (КПОС); несоблюдение методов контрацепции женщинами детородного возраста; беременность, лактация; заболевания опорно-двигательного аппарата, препятствующие проведению теста 6-минутной ходьбы.

Терапия селексипагом проводилась согласно алгоритму: начальная доза составила 200 мкг 2 раза в сутки с последующим индивидуальным подбором дозы препарата путем ее еженедельного увеличения с шагом 200 мкг 2 раза в сутки до достижения максимально переносимой (индивидуально подобранная поддерживающая доза селексипага) или до максимальной – 1600 мкг 2 раза в сутки [3,4].

Динамика состояния пациентов (тест 6-минутной ходьбы, КПОС, эхокардиография (ЭхоКГ), уровень мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) в плазме крови) отслеживалась в двух контрольных точках: на старте терапии селек-сипагом и через 12 месяцев его стабильного приема. Всем участникам исследования в первой и контрольной точке проводился сравнительный анализ клинических, гемодинамических параметров, в том числе способность Гб переносить кислород (контроль конформации Гб с помощью КР-спектроскопии).

Исследование изменений конформации гема и глобина эритроцитов крови и суспензии эритроцитов проводили с помощью КР-спектроскопии. Образец помещали в герметичный капилляр (диаметр 1 мм («АгатМед», РФ). Измерения проводили на конфокальном микроскоп-спектрометре NTEGRA-SPECTRA (NT-MDT, РФ) на базе микроскопа Olympus IX в диапазоне частотного сдвига 1000-3100 см ^{- 1} с шагом 1 см ^{- 1}, объектив 5х с апертурой 0,15, решетка 600, мощность лазера на образце менее 3мВт, длина волны возбуждения 532 нм, время регистрации сигнала — 30 секунд, количество накоплений сигнала — 3.

Для анализа изменений конформации гема и глобина проводилось сравнение соотношения интенсивностей полос КР-спектра, которые характеризуют конформацию гема (плоская, куполообразная) и плотность упаковки белка глобина, характерное для дезокси- и оксигемоглобина, соответственно.

Очистку суспензии эритроцитов (СЭ) от компонентов плазмы и белых форменных элементов крови проводили центрифугированием. Для этого к цельной крови добавляли физиологический буфер составом 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 4 мM Na2HPO4, 1 мM NaH2PO4, 1 мМ MgSO4, 5 мМ глюкозы (Sigma), рН 7,4 в соотношении 1:3, тщательно перемешивали и центрифугировали (Laborfuge 400R, Thermo Scientific, США) при 1500 g в течении 5 минут, t=+4°С. Осаждение эритроцитов повторяли дважды. Суспензию выделенных эритроцитов, используемых в экспериментах, хранили на льду не более 3 часов.

Для анализа изменения конформации гема и глобина были выбраны следующие соотношения интенсивностей полос спектра КР гема [6,7,8].

• 1.    I₁₃₇₅/I₁₁₇₂ — соотношение, ассиметричных и симметричных колебаний пиррольных колец в гемопорфирине;

• 2.    I₁₅₈₀/I₁₃₇₅ — соотношение валентных колебаний связей винильных групп к симметричным колебаниям пиррольных колец;

• 3.    I₁₅₈₀/I₁₅₅₀ — соотношение колебаний метиновых мостиков между пирролами в гемопорфирине;

• 4.    I₂₈₈₀/I₂₉₃₀ — соотношение колебаний Н-метиновых групп аминокислот глобина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В начале терапии селексипагом была проведена комплексная оценка клинико-демографических характеристик пациентов с ИЛГ. В наших исследованиях медиана возраста пациентов составляла 43,0 [40,0; 50,8] года, 78,6% пациентов были женщины, а медиана индекса массы тела (ИМТ) составила 27,0 [25,3; 31,5] кг/м ² . При анализе выраженности явлений сердечной недостаточности у 14,3% пациентов отмечалось наличие отечного синдрома, у 57,1% выпота в полости перикарда по данным ЭхоКГ.

Медиана дистанции в тесте 6-минутной ходьбы (Д6МХ) составила 405,0 [366,3; 438,3] м, что соответствует функциональному классу III ФК (ВОЗ), при этом медиана одышки по Боргу 5,0 [4,0; 5,0] баллов. У большинства пациентов отмечался III ФК (ВОЗ) – 11 (78,6%), лишь 3 (21,4%) пациентов имели II ФК (ВОЗ), пациенты с I и IV ФК (ВОЗ) не были представлены в выборке.

Медиана уровня NT-proBNP составила 550,1 [241,3; 1359,5] нг/л.

По данным ЭхоКГ медиана площади правого предсердия (S ПП) составила 26,5 [20,6; 29,5] см 2 . пр_И катетеризации правых отделов сердца (КПОС) получены следующие результаты: медиана среднего давления в легочной артерии 58,0 [52,0; 67,8] мм рт. ст., медиана среднего давления в правом предсердии 7,0 [5,0; 9,0] мм рт. ст., медиана сатурации смешанной венозной крови (SvO 2 ) 56,5 [53,8; 59,8] %, медиана сердечного индекса 1,8 [1,4; 2,1] л/мин/м², медиана легочного сосудистого сопротивления 16,5 [11,7; 18,6] единиц Вуда.

Клинико-демографические характеристики пациентов в начале терапии селексипагом представлены в таблице 1.

По результатам обследования пациентам селексипаг назначался в составе двойных (28,6%) и тройных (71,4%) схем комбинированной ЛАГ-специфической терапии. Наиболее распространенными схемами ЛАГ-специфической терапии были

Таблица 1. Исходная характеристика пациентов, которым назначался селексипаг

Table 1. Patient demographic and disease characteristics at selexipag initiation

Характеристика                                                                                 Данные (n=14)

Возраст на момент инициации терапии селексипагом, лет	43,0 [40,0; 50,8]
Женщины, %	78,6% (n=11)
ИМТ на момент инициации терапии селексипагом, кг/м2	27,0 [25,3; 31,5]
срДЛА в покое, мм рт. ст.	58,0 [52,0; 67,8]
СДЛА, мм рт. ст.	58,0 [52,0; 67,8]
ДПП, мм рт. ст.	7,0 [5,0; 9,0]
ДЗЛА, мм рт. ст.	7,5 [7,0; 8,8]
КПОС
СВ, л/мин	3,2 [2,7; 3,8]
СИ, л/мин/м2	1,8 [1,4; 2,1]
SvO2, %	56,5 [53,8; 59,8]
ЛСС, ед. Вуда	16,5 [11,7; 18,6]
Время от постановки диагноза ЛАГ до инициации терапии селексипагом, мес.	35,0 [10,0; 69,0]
Время от первого назначения ЛАГ-специфической терапии до назначения селексипага, мес.	25,0 [8,8; 69,0]
I                                                                                    0 (0)
II rhl/         имппп /0/\	3 (21,4)
ФК (ВОЗ), число (%)
III	11 (78,6)
IV	0 (0)
Д6МХ, м	405,0 [366,3; 438,3]
Одышка по шкале Борга, балл	5,0 [4,0; 5,0]
NT-proBNP, нг/л	550,1 [241,3; 1359,5]
Явления ПЖ СН, %	14,3 (n=2)
S ПП, см2	26,5 [20,6; 29,5]
Выпот в полости перикарда, %	57,1 (n=8)

Примечание/Note: данные представлены в виде медианы, 25% и 75% перцентилей (continuous data are summarized using median, interquartile range (IQR) and categorical data counts, and percentage of patients).

ДЗЛА – давление заклинивания легочной артерии (PCWP – pulmonary capillary wedge pressure); ДПП – среднее давление в правом предсердии (RAP – right atrial pressure); Д6МХ – дистанция в тесте 6-минутной ходьбы (6MWD – six-minute walking distance); ИЛГ – идиопатическая легочная гипертензия (iPAH – idiopathic pulmonary arterial hypertension); ИМТ – индекс массы тела (BMI – body mass index); ЛАГ – легочная артериальная гипертензия (PAH – pulmonary arterial hypertension); ЛСС – легочное сосудистое сопротивление (PVR – pulmonary vascular resistance); СДЛА – систолическое давление в легочной артерии (sPAP – systolic pulmonary arterial pressure); СВ – сердечный выброс (CO – cardiac output); СИ – сердечный индекс (CI – cardiac index); срДЛА – среднее давление в легочной артерии (mean RAP – mean right atrial pressure); ФК (ВОЗ) – функциональный класс по классификации Всемирной организации здравоохранения (FC (WHO) – functional class, World Health Organization); NT-proBNP – N-концевой фрагмент мозгового натрийуретического пептида (N-terminal pro-brain natriuretic peptide); S ПП – площадь правого предсердия (RAA – right atrial area); SvO2 – сатурация венозной крови (SvO2 – mixed venous oxygen saturation); ЭхоКГ – эхокардиография (ECHO – echocardiography);

комбинации стимулятора растворимой гуанилатциклазы риоци-гуата 7,5 мг/сут. и селексипага (14,4%) среди схем двойной комбинированной терапии, а среди тройных– комбинации селексипа-га, ингибитора фосфодиэстеразы 5 типа силденафила 60 мг/сут. или стимулятора растворимой гуанилатциклазы риоцигуата 7,5 мг/сут. с антагонистом рецепторов эндотелина мацитен-таном (21,4% для обеих схем терапии). Схемы стартовой ЛАГ-специфической терапии представлены ниже на рисунках 1 и 2.

Отметим, что медиана времени от постановки диагноза ЛАГ до назначения селексипага составила 35 (10-69) месяцев, а от первого назначения предшествующей ЛАГ-специфической терапии до присоединения селексипага – 25 (8,8; 69,0). Поддерживающая лекарственная терапия была продолжена у всех пациентов; наиболее часто назначаемыми группами препаратов стали антагонисты альдостерона (92,9%) и петлевые диуретики (85,7%), антикоагулянтную терапию различными группами препаратов как перорального, так и парентерального введения суммарно получали 78,6% пациентов. Стоит отметить, что включенные в исследование пациенты исходно имели отрицательный результат теста на вазореактивность и не получали терапию блокаторами кальциевых каналов.

При оценке состояния пациентов в контрольной точке через 12 месяцев после начала приема селексипага выявлено достоверное улучшение функционального статуса с увеличением Д6МХ до 445,0 [431,3; 512,0] м (p<0,05) и достоверным снижением выраженности одышки по шкале Борга до 3,0 [1,3; 3,0] баллов (p<0,05). Также отмечалось достоверное уменьшение уровня NT-proBNP до 242,3 [96,9; 816,3] нг/л.

Положительная динамика выявлена и при инвазивной оценке параметров гемодинамики в виде достоверного прироста сердечного выброса до 4,0 [3,2; 4,7] л/мин и сердечного индекса до 2,2 [2,1; 2,6] л/мин/м ² (p<0,05). Кроме того, антипролиферативное и

Силденафил+Селексипаг

Риоцигуат+Селексипаг

Мацитентан+Селексипаг

Силденафил+Мацитентан+Селексипаг

Риоцигуат+Бозентан+Селексипаг

Риоцигуат+Мацитентан+Селексипаг

Риоцигуат+Амбризентан+Селексипаг

Рисунок 1. Схемы двойной комбинированной ЛАГ-специфической терапии, включающей селексипаг, у пациентов с ИЛГ в динамике

Figure 1. Double combination PAH-specific therapy including selexipag in IPAH patients in dynamics

Кровь:

Рисунок 3. Характерный КР-спектр эритроцитов цельной крови (А) и изолированных эритроцитов (Б) до и после терапии селексипагом. Пояснения в тексте

Рисунок 2. Состав схем тройной комбинированной ЛАГ-специфической терапии, включающей селексипаг, у пациентов с ИЛГ в динамике

Figure 2. Triple combination PAH-specific therapy including selexipag in IPAH patients in dynamics

Figure 3. Representative Raman spectrum of whole blood of red blood cells (A) and isolated red blood cells (B) before and after treatment with selexipag. Explanations in the text

60 ЕВРАЗИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 4, 2023

антифибротическое действие селексипага на стенку легочной артерии привело к достоверному снижению легочного сосудистого сопротивления до 11,2 [9,4; 15,0] единиц Вуда (p<0,05), а также улучшению газообмена в сосудах легких и оксигенации тканей с достоверным повышением SvO ₂ до 64,5 [60,3; 66,8] % (p<0,05).

Несмотря на отчетливую положительную динамику в состоянии пациентов через 12 месяцев стабильной терапии селек-сипагом в составе двойных и тройных схем комбинированной ЛАГ-специфической терапии, 4 (28,6%) пациентам выполнена эскалация ЛАГ-специфической терапии в виде добавления третьего препарата или коррекции внутри схемы тройной терапии в виде замены препаратов, воздействующих на один механизм патогенеза (рис. 2 и 3).

При исследовании образцов крови пациентов с помощью КР-спектроскопии в КР-спектрах (рис. 3) были зарегистрированы полосы валентных колебаний гема (1000-1800 см ^{- 1}) и глобина (2800-3000 см ^{- 1}). После применения селексипага, в КР-спектрах выявлены характерные изменения: снижается интенсивность полосы 1640 см ^{- 1}, что коррелирует с содержанием комплексов Гб-NOx как в эритроцитах цельной крови, так и в изолированных эритроцитах. Для высокочастотной области характерно смещение положения полос 2850 и 2880 см ^{- 1} в низкочастотную область на 3±0,4 см ^{- 1}, что, вероятно, свидетельствует об изменении структуры белка за счет уменьшения длины сопряжения водородных связей в аминокислотных остатках молекулы глобина [9].

Исследование конформации Гб в цельной крови и СЭ до и после применения пациентами селексипага свидетельствует о том, что (рис. 4) эффект главным образом связан с изменением конформации гема за счет групповых колебаний пиррольных колец, валентных колебаний винильных групп гема, а конформации глобина за счет снижения плотности упаковки белка. Важно, что эти изменения были выявлены главным образом для Гб эритроцитов в цельной крови: выявлены различия в конформации пиррольных колец (I1580/I1375, I1375/I1172, I1580/I1580), которые свидетельствуют об увеличении сродства Гб с лигандами (в том числе с О2) и плотности упаковки белка глобина (I2880/I2930).

Далее нами была исследована динамика соотношений интенсивностей полос КР-спектра 14 пациентов после лечения селексипагом (рис. 5). В большинстве случаев после применения терапии селексипагом выявлено изменение конформации гема (снижение величины валентных колебаний винильных групп гема для эритроцитов цельной крови и для изолированных эритроцитов (I₁₅₈₀/I₁₅₅₀) и конофрмации глобина, которое сопровождается увеличением плотности упаковки глобина (I 2880 /I 2930 ).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что применение селекипага, как правило, вызывает существенные изменения конформации Гб: снижение вероятности «куполообразной» конформации гема за счет изменения групповых колебаний пиррольных групп гема (I1375/I1172), а вклад валентных колебаний винильных групп (I1580/I1550) в изолированных эритроцитах выше, чем в эритроцитах цельной крови; для конформации глобина характерно увеличение плотности.

Однако у некоторых пациентов выявлена иная тенденция изменения конформации гема: увеличение вероятности плоской конформации гема сопровождается увеличением вклада групповых колебаний пиррольных колец (I1375/I1172) при увеличении вклада валентных колебаний винильных групп. При этом отмечается снижением плотности упаковки глобина. Сказанное свидетельствует о специфическом действии препарата на пациентов, возможности выявления деталей воздействия и требует дальнейших исследований с учетом понимания действия сопутствующих факторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования показана клиническая эффективность агониста простациклиновых рецепторов селексипага в составе комбинированных схем ЛАГ-специфической терапии у пациентов с ИЛГ, а также существенное влияние проводимой терапии на конформацию Гб в эритроцитах цельной крови, что может применяться для оценки динамики состояния пациентов с помощью неинвазивной оптической спектроскопии.

Рисунок 4. Соотношение величины интенсивностей полос КР-спектра эритроцитов цельной крови (зеленые столбцы) и изолированных эритроцитов (оранжевые столбцы) пациентов с ИЛГ до и после применения селексипага (* обозначены статистически значимые различия между пробами контроля и ИЛГ (р<0,05), n=14)

Кровь до приема Селексипага

Кровь после приема Селексипага

СЭ до приема Селексипага

СЭ после приема Селексипага

• Figure 4.    The ratio of the intensities of the Raman spectrum bands of whole blood of red blood cells (green columns) and isolated red blood cells (orange columns) of patients with IPAH before and after the use of selexipag (* indicates statistically significant differences between control samples and IPAH (p<0,05), n=14)

  

  _,,,_,0_{505                                             *}

  
  
  
  
  

  ,0

  
  
  
  
  

  3,0 1

  2,5 1

  2,0 1

  1,5

  1,0

  0,5

  0,0

  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

  Кровь до приема Селексипага

  
  
  

  СЭ до приема Селексипага

  СЭ после приема Селексипага

  
  

  Соотношение

  
  
  
  
  
  
  
  

  Кровь после приема Селексипага

  
  
  
  
  

Рисунок 5. Соотношение интенсивностей полос КР-спектра эритроцитов цельной крови (зеленые столбцы) и изолированных эритроцитов (оранжевые столбцы) пациентов с ИЛГ до и после применения селексипага для 14 индивидуальных измерений пациентов (* обозначены статистически значимые различия между пробами контроля и ИЛГ (р<0,05))

• Figure 5.    The ratio of the intensities of the Raman spectrum bands of whole blood of red blood cells (green columns) and isolated red blood cells (orange columns) of patients with IPAH before and after the use of selexipag for 14 individual measurements of patients (* statistically significant differences between control and IPAH samples are indicated (p<0,05))

62 ЕВРАЗИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 4, 2023