Оценка эффективности применения офтальмологического ниосомального геля "Регенерин" в лечении химического ожога роговицы

та, формирование васкуляризованного бельма способствуют отторжению и некрозу трансплантата [4]. Цели лечения в остром периоде ожога глаз: коррекция процесса асептического воспаления, ускорение восстановления поверхности глаза (эпителизации), профилактика вторичной инфекции, контроль гипертензии и купирование болевого синдрома. Проблема восстановления поврежденной поверхности роговицы, ее целостности и прозрачности в офтальмологии крайне актуальна, поскольку в результате лечения не всегда удается сохранить ее физиологические свойства. Длительность течения и исходы ранений роговицы во многом зависят от репаративной (посттравматической) регенерации.

Цель : изучить эффективность применения офтальмологического ниосомального геля «Регенерин» при лечении смоделированного химического ожога роговицы в эксперименте.

Материал и методы. Ниосомальный гель получен на основе низкомолекулярных пептидов и других физиологически активных веществ, выделенных из плацентарных клеток, обладающих высоким регенераторным потенциалом [5]. Полученные пептиды инкапсулированы по запатентованной методике в кремнийорганические ниосомы [6]. Особенности анатомического и гистологического строения роговицы глаза кролика схожи со строением глаза человека, что позволяет осуществить экспериментальное исследование щелочного ожога, используя данный вид животных. Экспериментальные исследования выполнены на 40 глазах 20 кроликов породы шиншилла обоего пола массой 2,1–3,5 кг. Модель химического ожога воспроизведена при помощи 10%-ного раствора едкого натра, время экспозиции 20 секунд, после предварительной инсталляционной анестезии 0,5%-ным раствором Алкаина. Через 2 часа после нанесения ожога проводилась контрольная оценка тяжести ожогов роговой оболочки, затем животных распределяли по группам. У всех животных получены стандартные, тяжелые химические ожоги роговицы третьей степени. Лечение гелем начинали через 3 часа после нанесения химического ожога. Животные разделены на две группы по 10 кроликов (20 глаз в каждой группе). В первой опытной группе лечение осуществлялось с помощью нанесения 0,05 мл геля «Регенерин» на ожоговую поверхность 1 раз в сутки в течение 10 дней. Контролем служила группа животных, которым не проводили лечение. Наблюдение, уход, операции на животных, а также выведение их из эксперимента выполнялись согласно Хельсинкской декларации об использовании животных в экспериментальных исследованиях.

Химический состав препарата «Регенерин» изучался с использованием масс-спектрометрии. Для этого образец разбавляли в 10 раз водой I типа, затем осаждали центрифугированием в течение 4 минут при 12000 об/мин и температуре 10°C. Надосадочную жидкость использовали в качестве исследуемого образца для проведения масс-спектрометрического анализа. Полученный супернатант наносили на ячейки стального планшета для MALDI-TOF масс-спектрометрии (Bruker Daltonics, Германия) в объеме 1 мкл. Планшет сушили на открытом воздухе в течение нескольких минут с последующим нанесением поверх раствора матрицы, состоящего из α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в растворе, содержащем 500 мкл ацетонитрила, 475 мкл ультрачистой воды и 25 мкл трифторуксусной кислоты. Плашку высушивали на воздухе до образования кристаллов в течение 5 минут.

Масс-спектры получали в линейном режиме на MALDI-TOF масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics, Германия) при следующих параметрах: частота лазера 60 Гц, интенсивность лазера 10-50%, время задержки экстракции 110 нс PIE, напряжение первого источника ионов 19,4 kV, второго 17,3 kV, напряжение фокусирующей линзы 8 kV, напряжение линейного детектора 2,500 kV, диапазон масс 2000–20000 Da. Внутреннюю калибровку ранее указанного диапазона проводили с использованием точных значений масс бактериального тест-стандарта MBT (Bruker Daltonics, Германия). Суммарный масс-спектр генерировали из 20 случайно выбранных позиций каждой капли мишени (всего по 4000 выстрелов лазера). Для управления масс-спектрометром, включая установку режимов работы и регистрации масс-спектров, использовали программный пакет Daltonics flexControl v.3.3.64 (Bruker Daltonics, Германия), визуализацию и анализ полученных масс-спектров проводили в программе flexAnalysis v.3.3.65. Формирование промежуточных таблиц выполняли с использованием программных ресурсов пакета Microsoft Office 2010.

Результаты. В результате химического ожога на третьи сутки эксперимента в эпителиальных клетках роговицы появляется эозинофильная зернистость и мелкие вакуоли. Эпителиальные клетки увеличены в размерах (набухшие), имеют округлую форму. В краевой зоне роговицы наблюдаются отек, полнокровие сосудов, стазы. Через пять суток в эпителии роговицы отмечается выраженная гидропическая и баллонная дистрофия, некроз эпителиального пласта, десква-мация с образованием эрозий. Эндотелий местами десквамирован, в сохранившихся эндотелиальных клетках регистрируются дистрофические изменения, набухание эндотелия. В собственной оболочке ро- говицы фиксируется выраженный диффузный отек, который распространяется на всю толщу роговицы. Коллагеновые волокна пропитаны отечной жидкостью, набухшие, склеены между собой (рис. 1).

Рис. 1. Диффузный отек роговицы (5-е сутки). Окраска: гематоксилином и эозином (×200)

Воспалительная инфильтрация становится более интенсивной и распространяется на всю толщу роговицы. В инфильтрате преобладают полиморфноклеточные лейкоциты, лимфоциты, макрофаги. При экспериментальном щелочном ожоге глаза наблюдается серозный кератит в первые трое суток, затем серозный кератит на 4–5-е сутки переходит в гнойный.

Базальные клетки эпителия, залегающие в лим-бальной зоне, являются стволовыми (камбиальными) клетками эпителия роговичного фенотипа и обеспечивают постоянное восполнение нормального эпителиального покрова роговицы. В нашем эксперименте через семь суток после щелочного ожога дистрофические и деструктивные изменения в эпителии роговицы нарастают, отмечается некроз эпителия на значительном протяжении с образованием множества крупных эрозий. На дне эрозий наблюдается более интенсивная воспалительная инфильтрация. Многослойный плоский эпителий роговицы местами приподнят и отслоен за счет отека (рис. 2).

Под десквамированным на значительном протяжении эпителием фиксируется скопление отечной жидкости роговицы с выраженными дистрофическими и деструктивными изменениями. В собственной оболочке роговицы отмечается усиление отека и интенсивности воспалительной инфильтрации. Коллагеновые волокна пропитаны отечной жидкостью, набухшие, с выраженными участками деструкции и фрагментации волокон. Обнаружены также участки кератомаляции.

После нанесения 0,05 мл геля «Регенерин» на ожоговую поверхность 1 раз в сутки происходит снижение воздействия щелочи на роговицу. Так, на третьи сутки лечения в эпителиальной выстилке сохраняется упорядоченность слоев, отмечается восстановление целостности эпителиального пласта. Встречаются единичные клетки с признаками гидро-нической дистрофии. В собственной оболочке роговицы отек значительно уменьшился, определяются небольшие очаговые инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоцитов, плазматических клеток с небольшой примесью нейтрофилов. Патологиче-

Рис. 2. Отслоение эпителиального пласта роговицы (7-е сутки). Окраска: гематоксилином и эозином (×200)

Рис. 3. Данные масс-спектрометрического анализа препарата «Регенерин»

ские изменения в роговице купированы. Многослойный плоский эпителий роговицы восстанавливается на всем протяжении. Отмечается полная регенерация эндотелия роговицы. Клетки базального слоя (транзиторные амплифицирующие клетки) с ограниченной пролиферативной активностью существенно увеличивают митотическую активность.

В нашем эксперименте при раннем применении опытного образца препарата «Регенерин» на основе экстракта плаценты наблюдалось восстановление базальных мембран роговицы. Собственная оболочка роговицы приобретала нормальную гистологическую структуру, что, на наш взгляд, связано с содержанием большого количества факторов роста и других цитокинов. Так, согласно нашим данным, длина пептидов, входящих в состав опытного образца препарата «Регенерин», находится в пределах 20–200 аминокислотных остатков (рис. 3).

Основным преимуществом низкомолекулярных пептидов, по сравнению с высокомолекулярными белковыми регуляторами, является то, что при высокой биологической активности и тканеспецифич-ности у них отсутствует видоспецифичность и иммуногенность.

Обсуждение. Согласно данным научной литературы, пептиды с молекулярной массой 1000–10000 Da являются цитомединами. Цитомедины принимают непосредственное участие в поддержании структурного гомеостаза и регулировании функциональной активности клеточных популяций. Опубликованные результаты исследований свидетельствуют, что действие экстракта плаценты способствует заживлению не только чистых, но и инфицированных ран. Доказана биологическая эффективность экстракта плаценты на всех этапах заживления раневого дефекта. В формировании межклеточного матрикса и в процессах клеточной адгезии активное участие принимают факторы роста и низкомолекулярные пептиды, а уменьшение агрегации тромбоцитов достигается за счет противовоспалительного действия компонентов плаценты. Достоверно установлено, что водный экстракт плаценты стимулирует синтез коллагена, используемого для заживления раневого дефекта. Кроме того положительное влияние на регенеративные процессы организма проявляется в иммуномодулирующем действии, в частности в способности экстракта повышать образование иммуноглобулинов класса G (IgG) и М (IgM), уровень лимфокинов, а также оказывать противомикробное действие [9]. Результаты наших исследований позволяют утверждать, что при лечении гелем «Регенерин» воспалительные инфильтраты мелкие и располагаются преимущественно в субэпителиальных зонах. Отмечается преобладание в инфильтрате лимфоцитов, значительно уменьшается отек собственно оболочки, ослабляется набухание коллагеновых волокон при отсутствии очагов деструкции. Установлено стимулирующее влияние геля «Регенерин» на неоваскуляризацию роговицы после химического ожога, что, по нашему мнению, связано с содержанием в экстракте плаценты факторов, стимулирующих неоваскуляризацию (AGF и VEGF). Неоваскуляризация роговицы является защитным механизмом, направленным на ускорение репаративных процессов в поврежденной области, что целесообразно использовать в клинической практике, например при тяжелых ожогах или глубоких язвах.

Данные клинических исследований указывают, что при отсутствии источника регенерации рогового эпителия происходит полная гибель стволовых клеток, а устранение осложнений (перфорация, изъязвление), возможно достигнуть только за счет конъюнктивального эпителия [9]. Ввиду замедленного врастания в роговицу глубоких и поверхностных сосудов, это сопровождается формированием тотального фиброваскулярного паннуса (конъюнктивизация роговицы) [10]. В нашем эксперименте уже к седьмым суткам с момента лечения гелем «Регенерин» в роговице глаза кролика отмечается врастание сосудов в роговицу. Это способствует купированию отека и экссудативной реакции, что, на наш взгляд, связано с присутствием в составе экстракта плаценты фактора роста сосудов (AGF) и васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF). Согласно научным литературным источникам, данные факторы не только оказывают интенсивное влияние на проницаемость сосудов, но и являются мощными ангиогенными белками [10]. Установлено также присутствие в экстракте плаценты эпидермального фактора роста (EFG), фактора роста фибробластов (bFGF) и фактора роста кера-тиноцитов (KGF), трансформирующего фактора роста (TGF) альфа и бета, фактора роста гепатоцитов (HGF) и фактора роста нервов (NGF). Действие данных факторов направлено на стимуляцию процессов репаративной регенерации роговицы после химического ожога.

Заключение. В роговице при проведении экспериментального химического ожога в эпителии, эндо- телии и собственно оболочке наблюдается развитие воспалительных, дегенеративно-дистрофических и деструктивных изменений. Специфическими чертами дегенеративно-дистрофических изменений эпителия и эндотелия являются: развитие некроза, десквама-ция, гидропическая и баллонная дистрофия и изъязвления с образованием эрозий. Формируется отек и воспалительная инфильтрация с развитием серозного, а затем гнойного кератита с образованием очагов кератомаляции, набуханием и распадом коллагеновых волокон в собственной оболочке роговицы. В первые трое суток отмечается серозный кератит, который на четвертые-пятые сутки трансформируется в гнойный. На седьмые сутки на фоне гнойного кератита фиксируются очаги кератомаляции, деструкции коллагеновых волокон, отслойка эпителиального пласта и десквамация его на значительном протяжении с эрозированием поверхности. Эффективность лечения офтальмологическим ниосомальным гелем «Регенерин» при химическом ожоге доказана отсутствием деструктивных изменений в тканях роговицы при сохранении целости эпителиального пласта и эндотелия, купированием отека, рассасыванием воспалительных инфильтратов, полным восстановлением морфологической структура органа.