Оценка эффективности различных иммуногистохимических маркеров в стадировании и прогнозе мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря

заболевания за последние 10 лет составил 15,26%. Летальность от РМП на первом году с момента установления диагноза составляет 19,5% [1,2].

По клиническому течению выделяют поверхностный (Tis, Ta, T1), инвазивный (T2-T4) и метастатический РМП. Поверхностные и мышечно-инвазивные опухоли мочевого пузыря в 90-95% представлены уротелиальной карциномой, но отличаются по целому ряду молекулярно-генетических, морфологических и иммуногистохимических признаков.

Мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (МИРМП) — потенциально смертельное заболевание, так как без лечения больные погибают в течение 24 месяцев. У 50% больных МИРМП, оперированных радикально, развивается рецидив, что связано с морфологической стадией первичной опухоли и состоянием регионарных лимфатических узлов. Наиболее распространенная локализация метастазов уротелиального рака — регионарные лимфатические узлы (78%), печень (38%), легкие (36%), кости (27%), надпочечники (21%) и кишечник (13%), реже (1-8%) развиваются метастазы в сердце, головном мозге, почках, селезенке, поджелудочной железе, мозговых оболочках, матке, яичниках, простате и яичках [3–5]. Следует отметить, что в течение первого года течения заболевания группу МИРМП пополнят еще 15-30% больных с поверхностным РМП, у которых возникает рецидив опухоли с мышечной инвазией [6].

В России в 2011 г. среди впервые зарегистрированных больных РМП в 45,8% случаев диагностируются I-II, в 37,6% — III и в 16,6% — IV стадии заболевания по системе TNM. В большинстве случаев органосохраняющее лечение удается провести только в случае Т1-Т2 стадий заболевания. В Т3-Т4 стадиях выполняется цистэктомия или паллиативное лечение.

Результаты лечения РМП непосредственно связаны со стадией заболевания. Так, пятилетняя выживаемость в Т1 стадии составляет 90-80%, в Т2-70-63%, в Т3-53-32% и в Т4-28-5% [7, 8]. Вместе с тем частота ошибок в предоперационном периоде при определении стадии рака мочевого пузыря достигает 73% [9]. Даже морфологическое исследование может давать ошибку в определении глубины инвазии опухоли в 20-50% [10].

Правильно выбранная тактика лечения является принципиальным моментом для дальнейшей жизни больного. Так, после удаления мочевого пузыря качество жизни больных значительно снижается, и им устанавливается 1–2-я группа инвалидности. В то же время неоправданно длительное консервативное лечение может привести к гибели больных [7].

Сегодня изучено влияние на течение РМП более 30 прогностических факторов и установлено, что независимыми критериями, влияющими на общую выживаемость, являются только стадия опухоли и поражение метастазами регионарных лимфатических узлов (EAU-2009).

Однако компьютерная томография позволяет выявить только 35-40% метастатически пораженных лимфатических узлов, а тонкоигольная аспирационная биопсия лишь незначительно улучшает диагностику, так как ее чувствительность не превышает 60%, а выполняется эта процедура лишь при увеличенных лимфоузлах [11].

Поражение регионарных лимфатических узлов при инвазивном раке мочевого пузыря является крайне неблагоприятным прогностическим фактором. Показано, что 50% больных умирают в течение 12 месяцев с регионарными метастазами в лимфатические узлы и 87% в течение 24 месяцев после цистэктомии; пятилетняя выживаемость составляет менее 7%. Расширенная лимфодиссекция и системная химиотерапия достоверно улучшают выживаемость этих больных. Поэтому дооперационная диагностика метастазирования в лимфоузлы может существенно повлиять на выбор тактики лечения в этой группе [12].

Кроме глубины инвазии опухоли и метастатического поражения лимфатических узлов, на прогноз МИРМП влияет степень злокачественности переходно-клеточной карциномы. Однако при мышечно-инвазивном РМП, как правило, не встречаются уротелиальные опухоли с низким злокачественным потенциалом или высокодифференцированные (G1) карциномы. В большинстве случаев определяется уротелиальный рак высокой степени злокачественности (G2 или G3 по классификации ВОЗ, 2004).

Ошибки в стадировании заболевания на основании клинических и рутинных гистологических исследований стимулировали интерес к иммуногистохимии, позволяющей прогнозировать характер течения болезни у каждого конкретного больного на основании изучения молекулярных маркеров. Наиболее изученными генами, вовлеченными в регуляцию клеточного цикла, являются гены-супрессоры опухоли p53 и p21. Ген р53 регулирует клеточный цикл и апоптоз, контролирует целостность генома. Активируясь в ответ на самые разные неблагоприятные воздействия, p53 осуществляет на транскрипционном уровне одновременно и активацию гена bax, и супрессию гена bcl-2, отвечающих за апоптоз. При развитии неоплазий, в том числе и переходно-клеточных карцином, часто отмечаются соматические мутации гена р53. Мутации р53 при карциномах уротелия выявляют в 29-53% случаях, однако мнения авторов о прогностической ценности этого показателя противоречивы [13].

Пролиферативная активность клетки может быть оценена при помощи различных методик. К ним относятся подсчет количества митозов, подсчет количества Ki67-позитивных клеток, выявление антигена ядра пролиферирующей клетки (PCNA), р63. Исследование Ki-67 позволяет прогнозировать темп роста опухоли и реакцию опухоли на проводимую химиотерапию (Наша). Ki-67 также является независимым прогностическим фактором в отношении рецидиви-рования у больных с поверхностными формами РМП, имеющих высокий риск [6]. Сведения о влиянии Ki-67 на течение МИРМП у больных противоречивы и изучены недостаточно.

Цель: провести сравнительную оценку эффективности различных иммуногистохимических маркеров в стадировании и прогнозе мышечно-инвазивного РМП.

Материал и методы. Материалом для исследования послужил операционный материал 80 пациентов с новообразованиями мочевого пузыря, проходивших лечение в НИИ клинической и фундаментальной уронефрологии СГМУ, и группы контроля (табл.1).

Операционный и биопсийный материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. Срезы толщиной 5–7 мкм,

Таблица 1

Характеристика исследуемых больных

Показатель	Количество больных
	абс.	%
Общее число РМП	80	100
Средний возраст, годы	63±0,5
Мужчин	68	85
Женщин	12	15

Показатель	Количество больных
	абс.	%

Стадия заболевания

Т0N0M0 — группа сравнения	14	17,5
ТаN0M0	15	18,7
Т1N0M0	9	11,2
T2N0M0	23	28,7
T3аN0M0	6	7,5
T3bN1M0	2	2,5
T4aN0M0	7	7,5
T4a-bN1M0	2	2,5
T4a-bN1M1	2	2,5

Гистологический диагноз

Переходно-клеточный рак	66	82,5
Цистит	14	17,5

Гистологическая степень злокачественности у больных РМП

G- 1 24 36,3 G- 2 22 33,3 G- 3 20 30,4 окрашенные гематоксилином и эозином, были подвергнуты обзорному морфологическому анализу, при котором стадию рака определяли в соответствии с классификацией TNM, а степень дифференцировки опухолевых клеток оценивали в соответствии с рекомендациями ВОЗ, 2004.

Изучение препаратов проводили с применением бинокулярного микроскопа «Micros MC100» при 600-кратном увеличении (объектив 40х, бинокулярная насадка 1,5х, окуляры 10х). Материал был разделен по группам с учетом клинической стадии рака. Всего исследовано 94 образца, 3120 срезов. Для иммуногистохимического исследования использованы 12 коммерческих моноклональных антител, разделенных на группы по функциональной значимости:

маркеры пролиферативной активности — Ki-67, PCNA, p63;

супрессор опухолевого роста — р53;

маркер апоптоза — Bcl-2;

рецептор эпидермального фактора роста — EGFR;

цитокератиновый профиль — ЦК7, ЦК8, ЦК10/13, ЦК17, ЦК18, ЦК19.

Иммуногистохимические реакции ставили на серийных парафиновых срезах (5 мкм), используя стрептавидин-биотиновый метод. В качестве детек-ционной системы применяли систему LSAB2 System, HRP (K0675), Dako, в качестве хромогена — диаминобензидин (Dako).

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме (цитокератины 7, 8, 13, 17, 18, 19) и на мембранах клеток (EGFR) оценивали полуколиче-ственным способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью светового бинокулярного микроскопа «Micros MC100», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 — отсутствие реакции, 1 — слабая реакция, 2 — умеренная реакция, 3 — сильная реакция.

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki-67, p53, p63, bcl-2), оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения, выражая полученные результаты в процентах.

Система оценки результатов реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki-67, p53, p63, bcl-2), включала интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-балльной шкале и долю (%) окрашенных клеток.

Статистический анализ проводили с использованием пакета программ статистической обработки результатов SSPS 13.0 for Windows.

Результаты. При иммуногистохимическом исследовании 12 онкомаркеров установлено, что для диагностики стадии рака мочевого пузыря и прогноза заболевания рационально использовать только 4 маркера: Ki-67, p63, р53 и EGFR. В табл. 2 дана сравнительная оценка эффективности иммуногистохимических маркеров для определения стадии РМП.

Таблица 2

Сравнительная оценка эффективности иммуногистохимических маркеров при мышечнонеинвазивном и мышечно-инвазивном РМП

Исследуемые группы	Иммуногистохимические маркеры
	р53	Ki-67	р63	EGFR
Группа сравнения T0N0M0 n=14	0	0	0	0
МНРМП Та-1N0M0 n=24	3 (12,5%)	12 (50%)	7 (29%)	1 (4,1%)
МИРМП T2-4N0-1M0–1 n=42	19 (45,2%)	32 (76,1%)	23 (54,7%)	7 (16,6%)

Из табл. 2 видно, что данные маркеры не дают положительной экспрессии в группе сравнения, что может использоваться при дифференциальной диагностике РМП и других неоплазий. Кроме этого, процент экспрессирующих клеток указанных маркеров позволяет судить о степени инвазии РМП, что является важным моментом для определения стадии заболевания, а следовательно, и прогноза.

При анализе показателей экспрессии маркеров в каждую из стадий РМП, представленной в табл. 3, установлено, что маркер Ki-67 показал 100%-ную экспрессию у пациентов со стадией РМП Т3 и Т4, в то время как в стадию Т2 его экспрессия составила только 56,5%, что является достоверным различием.

Исследования показали: Ki-67 можно весьма перспективно использовать для дифференциальной диагностики между Т2 и Т3-Т4, что является очень важным, так как выход опухоли за пределы органа свидетельствует о неблагоприятном прогнозе. Именно поэтому этот маркер может быть использован как прогностический, способный повлиять на выбор тактики лечения у больных МИРМП.

С целью определения прогностической значимости изучены отдаленные результаты лечения 27 больных РМП, чью судьбу удалось проследить на протяжении 5 лет. У всех пациентов при иммуногистохимическом исследовании ткани опухоли Ki-67 дал положительную экспрессию. Эти данные представлены в табл. 4.

Из 27 больных РМП 11 пациентам выполнено органосохраняющее комплексное лечение, включающее в себя трансуретральную электрорезекцию стенки мочевого пузыря вместе с опухолью и системную полихимиотерапию по схеме M–VAC (метотрексат, винбластин, доксорубицин, цисплатин). У 13

больных произведена цистэктомия, а шесть пациентов признаны иноперабельными, им осуществлялась только симптоматическая терапия.

Из табл. 5 видно, что из 27 больных РМП 16 (59,2%) умерли. Из них 10 (62,5%) в первый год. Из 10 умерших в первый год 9 (90%) пациентов имели

Показатели экспрессии иммуногистохимических маркеров РМП у больных в зависимости от стадии заболевания

Таблица 3

Маркер Стадия	Количество больных в группе	Положительный результат
		р53	Ki-67	PCNA	р63	EGFR
T0N0M0	14	0	0	9 (64,2%)	0	0
TaN0M0	15	13%	46,6%	13%	13%	0
T1N0M0	9	11%	55,5%	11%	55%	11,1%
T2N0M0	23	43%	56,5%	43%	52%	8,6%
T3N0-1M0	8	50%	100%	50%	75%	25%
T4N0-1M0-1	11	45%	100%	45%	45,4%	27,2%
Всего больных РМП	66	22	44	31	30	8

Прогнозирование исходов лечения с помощью Ki-67 у пациентов РМП

Таблица 4

№	Возраст	Категория pTNMG	Лечение	Ki-67, %	Продолжительность жизни
1	63	T3бN1M0G2	ЦЭ	33	До 1 года
2	66	T4N1M0G2	ЦЭ	45	До 1 года
3	54	Т4N1M0G3	ХТ+ЦЭ	30	До 1 года
4	69	T3бN1M0G3	ЦЭ	70	До 1 года
5	57	T3бN0M0G2	ХТ+ЦЭ	40	До 1 года
6	61	T2N0M0G3	ТУР, Л+Х	35	До 1 года
7	75	T4N1M1G2	Паллиативное	50	До 1 года
8	54	T4N0M0G3	ХТ+ЦЭ	80	До 1 года
9	59	Т3N0M0G3	ХТ+ЦЭ	15	До 1 года
10	61	T4N1M1G2	Паллиативное	40	До 1 года
11	82	T3N0M0G3	Паллиативное	36	До 1 года
12	71	R1TaN0M0G1	TУР	15	До 1 года
13	51	T2N0M0G2	TУР	35	До 2 лет
14	75	T3N0M0G2	ТУР	80	До 2 лет
15	58	R1T2N0M0G3	ЦЭ	24	До 2 лет
16	74	R1T2N0M0G3	ТУР	80	До 2 лет
17	44	T2N0M0G2	ХТ+ЦЭ	11	Более 5 лет
18	68	T2N0M0G2	ЦЭ	25	Более 5 лет
19	71	R1T2N0M0G2	ТУР	5	Более 5 лет
20	72	T1N0M0G1	ТУР	25	Более 5 лет
21	46	T3N0M0G2	ХТ+ЦЭ	10	Более 5 лет
22	56	T2N0M0G2	ХТ+ЦЭ	50	Более 5 лет
23	76	T1N0M0G1	ТУР	20	Более 5 лет
24	45	T1N0M0G1	ТУР	20	Более 5 лет
25	44	R1T2N0M0G2	ТУР	34	Более 5 лет
26	47	T1N0M0G1	ТУР	44	Более 5 лет
27	57	R7T2N0M0G2	ЦЭ	12	Более 5 лет

П р и м еч а н и е : ТУР — трансуретральная резекция мочевого пузыря; ЦЭ — цистэктомия; ХТ — системная полихимиотерапия; ЛТ — лучевая терапия.

экспрессию Ki-67>30%. У всех 9 больных стадия заболевания была Тзb-T4N0-1M0–1.

Методы лечения у больных РМП с положительной экспрессией Ki-67

Таблица 5

% экспресси-рующих клеток Ki-67	Метод лечения (n=27)			Выживаемость (n=27)
	Резекция МП, ТУР+ХТ	Цистэктомия	Паллиатив-ная	Умерли в течение 2 лет	Живы 5 лет и более
Ki-67 ≤ 30%	5	6	-	3	8
Ki-67 ≥ 30%	6	7	3	13	3

В то же время из 11 больных РМП, которые прожили более 5 лет, в 73% случаев экспрессия Ki-67 составила <30%. Стадия заболевания у выживших больных: Т1N0M0–4; Т2N0M0-6; Т3N0M0–1.

Обсуждение. При мышечно-инвазивном РМП Т2N0M0-Т3-4N0-1M0–1 (22 больных) в первые 24 месяца умерло 14 (62%). Экспрессия Ki-67 у этих больных колебалась от 30 до 80%.

При органосохраняющем лечении больных в стадии Т1-Т2 (11 пациентов) в первые два года умерло 5 (45,4%) больных, у которых экспрессия Ki-67 составляла >30%. После цистэктомии (n=13) умерли 8 (61,5%), у 7 (87,5%) из них Ki-67 был >30%. Из 11 пациентов, проживших 5 лет и более, только в двух случаях Ki-67 был >30% (34% и 44%), у остальных 9 (82%) Ki-67 был менее 30%.

Проведенная сравнительная оценка эффективности различных иммуногистохимических маркеров в стадировании и прогнозе мышечно-инвазивного РМП показала, что наиболее эффективным маркером является маркер пролиферативной активности Ki-67. Установлено, что при экспрессии Ki-67 >30%, независимо от способа лечения, в 81,2% возможен рецидив заболевания и летальный исход в течение 24 месяцев. В то же время при значениях Ki-67 <30% пятилетняя выживаемость составляет 70%.

Заключение. Таким образом, маркер пролиферативной активности Ki-67 может быть использован в качестве вспомогательного маркера при выборе объема оперативного лечения (органосохраняющая операция или цистэктомия). Независимо от способа лечения в 81,2% случаев Ki-67 может предсказать неблагоприятный исход заболевания в течение 24 месяцев.