Оценка лактозо-конвертирующей способности дрожжей Kluyveromyces lactis в зависимости от концентрации цинка в среде культивирования

Автор: Аббас К.С., Лушникова Е.С., Новочадов В.В.

Журнал: Природные системы и ресурсы @ns-jvolsu

Статья в выпуске: 1 т.14, 2024 года.

Бесплатный доступ

Постоянно возрастающие объемы отходов пищевой промышленности, содержащих лактозу, до половины которой в итоге попадает в сточные воды, обусловливают необходимость разработки более эффективных способов ее утилизации. Наиболее перспективные из них основаны на увеличении лактозо-конвертирующей способности микроорганизмов, прежде всего - дрожжей, используемых в данной экологической биотехнологии. Ряд таких модификаций использует возможность увеличения активности ключевых ферментов конвертации лактозы за счет добавления в среду ряда биогенных микроэлементов. В статье рассмотрены эффекты цинка на эффективность ферментации подсырной сыворотки тремя коммерческими культурами Kluyveromyces lactis, для чего оценивали содержание лактозы в культуральной среде до начала и спустя пять суток ферментации. Штамм K. lactis культуры MicroMilk KF KL утилизировал от 80,2 до 84,2 % лактозы, при добавлении ионов цинка эти показатели находились пределах от 74,5 до 85,7 %. Штамм культуры Здоротеево продемонстрировал утилизацию лактозы в контрольной серии от 78,7 до 82,0 %, при добавлении ионов цинка в концентрации 2 ПДК утилизация была несколько выше, при концентрации 5 ПДК - ниже значений в контроле. Содержание лактозы в культуры STANDA KL D в контрольной серии варьировало пределах от 41,5 до 59,0 %, при добавлении ионов цинка в концентрации 2 ПДК - от 50,5 до 69,0 %, при концентрации ионов цинка 5 ПДК - от 38,7 до 57,4 %. Таким образом, добавление ионов цинка в среду культивирования K. lactis в концентрации 2 ПДК несколько повышает лактозо-конвертирующую способность дрожжей, а в концентрации 5 ПДК - угнетает ее. Полученные данные целесообразно использовать при выработке стратегии очистки лактозо-содержащих отходов в пищевой промышленности.

Еще

Молочная сыворотка, экологические биотехнологии, биоэтанол, возобновляемое сырье, kluyveromyces lactis, цинк

Короткий адрес: https://sciup.org/149146357

IDR: 149146357 | DOI: 10.15688/nsr.jvolsu.2024.1.2

Текст научной статьи Оценка лактозо-конвертирующей способности дрожжей Kluyveromyces lactis в зависимости от концентрации цинка в среде культивирования

DOI:

Цитирование. Аббас Кайс С., Лушникова Е. С., Новочадов В. В. Оценка лактозо-конвертирующей способности дрожжей Кluyveromyces lactis в зависимости от концентрации цинка в среде культивирования // Природные системы и ресурсы. – 2024. – Т. 14, № 1. – С. 18–25. – DOI:

По оценкам BusinesStat, с 2019 по 2023 г. производство сыра в России увеличилось на 40 %, до 758 тыс. т ежегодно. Причиной этому стали санкции против России, поскольку до введения эмбарго на импортные сыры приходилось до 50 % всего объема российского рынка [1]. Ежедневно в мире производится более 100 т молочной сыворотки, которая является неизбежным отходом пищевой про- мышленности. В настоящее время большая ее часть никак не используется и утилизируется путем простого слива, что наносит ощутимый вред окружающей среде [5; 10; 11]. По данным компании Kieselmann Rus, ущерб, наносимый природе одной тонной сыворотки, приравнивается к ущербу от 100 т обыкновенных хозяйственно-бытовых стоков [6].

Трансформация лактозы в этанол позволяет завершить технологическую цепочку, тем самым сокращая существенно сокращая убытки и уменьшая ущерб от загрязнения окружающей среды [13; 14]. Кроме того, использование дрожжей для ферментации возобновляемой биомассы для производства биоэтанола является многообещающей тенденцией для развития новой энергетики [2; 7; 20].

В качестве биообъектов для ферментации лактозы в последнее время ученых и практиков привлекают дрожжи Kluyveromyces lactis [12; 18]. Впервые геном K. lactis был исследован в Институте Пастера в Париже путем секвенирования 588 коротких меток из двух случайных геномных библиотек, было идентифицировано 296 генов, из которых 292 – новых. Полный геном K. lactis был секвенирован в 2004 г. в рамках проекта «Génolevures» и включает примерно 5 300 генов [9; 12]. K. lactis зарекомендовали себя как привлекательная микробная экспрессионная система для рекомбинантных белков в промышленных масштабах. Его гены LAC позволяют использовать недорогую сахарную лактозу в качестве единственного источника углерода и энергии [3].

Цель работы – в модельном эксперименте in vitro сопоставить эффективность утилизации лактозы тремя коммерческими штаммами дрожжей из сырьевой среды, содержащей 40 г/л и 80 г/л лактозы, в зависимо- сти от концентрации ионов цинка в культуральной среде.

Материал и методы

В работе для изучения лактозо-перерабатывающей способности основных использованы три коммерческих штамма дрожжей рода K. lactis :

– Здоротеево (Россия);

– STANDA KL D (Франция);

– MicroMilk KF KL (Италия).

На этапе подготовки к культивированию были подготовлены две питательные среды – депротеинезированная нативная подсырная сыворотка А с содержанием лактозы 40 г/л и упаренная сыворотка В с содержанием лактозы 80 г/л. В каждой серии эти сыворотки ферментировались одной из дрожжевых культур с добавлением раствора ZnSO4 до конечной концентрации 10 мг/л (2 ПДК) и 25,0 мг/л ионов цинка (5 ПДК), соответственно. В каждую пробирку для культивирования было добавлено: питательная среда (сыворотка А или В) – 3 мл, дрожжевая суспензия – 1,75 мл и 0,25 мл добавочного раствора. Культивирование дрожжевых культур проводилось в закрытых химических пробирках при поддержании постоянной температуры в 37,5 °C в течение 5 суток. Каждая серия включала шесть повторов (см. таблицу).

Состав модельных образцов

Серия	Вид сыворотки	Вид дрожжевой культуры	Количество ионов Zn+ в добавочном растворе
А1-0	Сыворотка А	Дрожжевая культура Здоротеево	0 ПДК
А1-2			2 ПДК
А1-5			5 ПДК
А2-0		Дрожжевая культура STANDA KL D	0 ПДК
А2-2			2 ПДК
А2-5			5 ПДК
А3-0		Дрожжевая культура MicroMilk KF KL	0 ПДК
А3-2			2 ПДК
А3-5			5 ПДК
B1-0	Сыворотка В	Дрожжевая культура Здоротеево	0 ПДК
B1-2			2 ПДК
B1-5			5 ПДК
B2-0		Дрожжевая культура STANDA KL D	0 ПДК
B2-2			2 ПДК
B2-5			5 ПДК
B3-0		Дрожжевая культура MicroMilk KF KL	0 ПДК
B3-2			2 ПДК
B3-5			5 ПДК

Лактозо-перерабатывающую способность дрожжей оценивали по содержанию лактозы в образцах адаптированным методом количественной оценки редуцирующих сахаров на основе спектрофотометрического метода Бенедикта [15; 17]. Для этого соединяли в пробирке 1 мл реактива Бенедикта и 0,25 мл образца, затем нагревали в течение 15 мин. при 95 °C, далее центрифугировали на 800 g в течение 5 мин. Супернатант разбавляли стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:4 и проводили спектрофотометрическое измерение при длине волны 740 нм.

Статистическая обработка количественных результатов, после исключения нормального характера распределения в выборках, предусматривала расчет медианы, разброса между первым и третьим квартилем (Me, Q1 ^ Q3)

и расчет показателя статистической значимости различий по критерию Манна-Уитни ( p < 0,05).

Результаты и обсуждение

Данные о содержании лактозы в модельных смесях после ферментации представлены на рисунках 1–3.

Эксперименты показали, что все тестируемые штаммы могут успешно производить этанол из лактозы. Культуры MicroMilk KF KL и Здоротеево показали высокую лактозо-кон-вертирующую активность, в то время как культура STANDA KL D демонстрировала более низкие показатели. Так, за 5 суток штамм K. lactis культуры MicroMilk KF KL утилизировал 84,2 % и 80,2 % лактозы при ее содер-

Рис. 1. Содержание лактозы после культивирования дрожжевой культуры MicroMilk KF KL на средах с различным содержанием ионов цинка

Примечание. Знаком * здесь и на последующих рисунках отмечены достоверные различия с контролем; # – между группами с умеренным и высоким содержанием цинка в культуральной среде ( p < 0,05 по критерию Манна-Уитни).

Рис. 2. Содержание лактозы после культивирования дрожжевой культуры Здоротеево на средах с различным содержанием ионов цинка

жании в среде 40 г/л и 80 г/л, соответственно, при добавлении ионов цинка эти показатели варьировали в пределах от 74,5 до 85,7 %. Штамм культуры Здоротеево продемонстрировал утилизацию лактозы в контрольной серии в пределах от 78,7 до 82,0%, при добавлении ионов цинка в концентрации 2 ПДК несколько увеличивалась от 84,2 до 86,3 %, при концентрации ионов цинка 5 ПДК – оказывались ниже контроля, менее 70,0 %.

Содержание лактозы в культуры STANDA KL D в контрольной серии варьировало пределах от 41,5 до 59,0 %, при добавлении ионов цинка в концентрации 2 ПДК – от 50,5 до 69,0 %, при концентрации ионов цинка 5 ПДК – от 38,7 до 57,4 %.

Дрожжи являются лидерами в биотехнологиях, основанных на ферментации. Они способны преобразовывать множество органических веществ из окружающей среды в совершенно новые, которые используются в различных сферах деятельности человека. Однако на этом пути микроорганизмы сталкиваются с несколькими типами стрессов, наиболее частыми из которых являются осмотический, стресс от недостатка питательных веществ и от накопления в среде токсических продуктов жизнедеятельности [19]. Из дрожжей наиболее востребованы в биотехнологии различные виды рода Saccharomyces [4; 11; 16], но для утилизации лактозы все чаще специалисты обращают внимание на представителей рода Kluyveromyces [12; 18]. В процессе ферментации они, как и любые дрожжи, под- вергаются воздействию стрессирующих ряда факторов, которые могут уменьшить активность их ферментов и, в итоге – снизить эффективность биотехнологического процесса [16].

Как известно, цинк является важным элементом для нормального роста, метаболизма и физиологии дрожжей. Помимо того, что он действует как кофактор для многих ферментов, цинк также необходим для структурной стабильности белков цинкового пальца, многие из которых оказывают важное влияние на клеточные метаболические процессы [8]. Недавние результаты демонстрируют участие белков цинкового пальца в клеточных стрессовых реакциях, с акцентом на повышение стрессоустойчивости дрожжей при производстве биоэтанола [19]. Глубокое понимание роли цинка в перепрограммировании метаболической сети дрожжей жизненно важно для выведения устойчивых штаммов дрожжей для сбраживания этанола, а также для улучшения качества продукции.

Заключение

Проведенные исследования позволяют считать, что современные штаммы K. lactis способны к конверсии лактозы в этанол, и в этой способности существенно превосходят классические спиртообразующие штаммы S. cerevisiae. Высокие показатели лактозо-перерабатывающей способности получены для дрожжевых культур MicroMilk KF KL и Здо-ротеево, у которых утилизация лактозы нахо-

Рис. 3. Содержание лактозы после культивирования дрожжевой культуры STANDA KL D на средах с различным содержанием ионов цинка

дится вблизи или превышает 80 %. Для дрожжевых культур K. lactis добавление ионов цинка в среду культивирования в концентрации 2 ПДК немного повышает лактозо-перерабатывающую способность дрожжей, а в концентрации 5 ПДК – угнетает ее. Полученные данные целесообразно использовать при выработке стратегии очистки лактозо-содержащих отходов в пищевой промышленности.

Список литературы Оценка лактозо-конвертирующей способности дрожжей Kluyveromyces lactis в зависимости от концентрации цинка в среде культивирования

Анализ рынка сыров в России в 2019–2023 гг., прогноз на 2024–2028 гг. Структура розничной торговли // BusinesStat. – 2023. – Электрон. текстовые дан. – Режим доступа: https://marketing.rbc.ru/research/27985/. – Загл. с экрана.
Исина, Н. Ю. Финансовый механизм внедрения эколого-ориентированной технологии переработки молочной сыворотки / Н. Ю. Исина // Труды Костромской государственной сельскохозяйственной академии. – 2020. – № 90. – С. 111–119.
Молекулярный полиморфизм генов в-галактозидазы LAC4 у молочных и природных штаммов дрожжей Kluyveromyces / Л. В. Лютова [и др.] // Молекулярная биология. – 2021. – Т. 55, № 1. – С. 75–85. – DOI: https://doi.org/10.31857/S0026898421010109
Оценка эффективности процесса биосинтеза этанола дрожжами рода Saccharomyces / И. В. Калинина [и др.] // Вестник ЮУрГУ. Серия: Пищевые и биотехнологии. – 2018. – Т. 6, № 4. – С. 74–82. – DOI: https://doi.org/10.14529/food180410
Bioethanol Production from Renewable Raw Materials and Its Separation and Purification: A Review / A. Bušić [et al.] // Food Technol. Biotechnol. – 2018. – Vol. 56, № 3. – P. 289–311. – DOI: https://doi.org/10.17113/ftb.56.03.18.5546
Bioethanol Production from Renewable Sources: Current Perspectives and Technological Progress / H. Zabed [et al.] // Renewable Sustainable Energy Rev. – 2017. – Vol. 71. – P. 475–501. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.rser.2016.12.076
Bioprospecting of Microbial Strains for Biofuel Production: Metabolic Engineering, Applications, and Challenges / M. F. Adegboye [et al.] // Biotechnol. Biofuels. – 2021. – Vol. 14, № 1. – e5. – DOI: https://doi.org/10.1186/s13068-020-01853-2
Cellular Stress Impact on Yeast Activity in Biotechnological Processes – A Short Overview / M. Postaru [et al.] // Microorganisms. – 2023. – Vol. 11, № 10. – e2522. – DOI: https://doi.org/10.3390/microorganisms11102522
Genome-Wide Metabolic (Re-) Annotation of Kluyveromyces lactis / O. Dias [et al.] // BMC Genomics. – 2012. – Vol. 13. – e517. – DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-517
Ethanol Production from Cheese Whey and Expired Milk by the Brown Rot Fungus Neolentinus lepideus / K. Okamoto [et al.] // Fermentation. – 2019. – Vol. 5, № 2. – e49. – DOI: https://doi.org/10.3390/fermentation5020049
Fermentation of Lactose to Ethanol in Cheese Whey Permeate and Concentrated Permeate by Engineered Escherichia coli / L. Pasotti [et al.] // BMC Biotechnology. – 2017. – Vol. 17, № 1. – P. 48–57. – DOI: https://doi.org/10.1186/s12896-017-0369-y
Kluyveromyces marxianus Developing Ethanol Tolerance During Adaptive Evolution with Significant Improvements of Multiple Pathways / W. Mo [et al.] // Biotechnol Biofuels. – 2019. – Vol. 12. – P. 63–72. – DOI: https://doi.org/10.1186/s13068-019-1393-z
Papademas, P. Technological Utilization of Whey Towards Sustainable Exploitation / P. Papademas, P. Kotsaki // Adv. Dairy Res. – 2019. – Vol. 7, iss 4. – e231. – DOI: https://doi.org/10.35248/2329-888X.19.7.231
Promising Renewable Raw for Ethanol Biosynthesis / Yu. A. Zimina [et al.] // Eur. J. Mol. Biotech. – 2020. – Vol. 8, № 1. – P. 42–51. – DOI: https://doi.org/10.13187/ejmb.2020.1.42
Quantification of Reducing Sugars Based on the Qualitative Technique of Benedict / A. Hernández-Lуpez [et al.] // ACS Omega. – 2020. – Vol. 5, № 50. – P. 32403–32410. – DOI: https://doi.org/10.1021/acsomega.0c04467/
Selection and Subsequent Physiological Characterization of Industrial Saccharomyces cerevisiae Strains During Continuous Growth at Suband- Supra Optimal Temperatures / K. Y. F. Lip [et al.] // Biotechnol. Rep. (Amst). – 2020. – Vol. 26. – e00462. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.btre.2020.e00462
Simoni, R. D. Benedict’s Solution, a Reagent for Measuring Reducing Sugars: the Clinical Chemistry of Stanley R. Benedict / R. D. Simoni, R. L. Hill, M. Vaughan // Journal of Biological Chemistry. – 2002. – Vol. 277, № 16. – P. 33–45. – DOI: https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)61050-1
Vu, H. H., Structural Basis for Substrate Recognition of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase from Kluyveromyces lactis / H. H. Vu, C. Jin, J. H. Chang // Biochem. Biophys. Res. Comm. – 2021. – Vol. 155, № 1. – P. 85–91. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2021.02.088
Walker, G. M. Mitigating Stress in Industrial Yeasts / G. M. Walker, T. O. Basso // Fungal Biol. – 2020. – Vol. 124, № 5. – P. 387–397. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.funbio.2019.10.010
Zandona, E. Whey Utilization: Sustainable Uses and Environmental Approach / E. Zandona, M. Blaћiж, A. Reћek Jambrak // Food Technol. Biotechnol. – 2021. – Vol. 59, № 2. – P. 147–161. – DOI: https://doi.org/10.1016/j.btre.2020.e00462

Еще

Статья научная