Оценка морфо-функционального состояния печени при токсическом гепатите

Актуальность темы. В настоящее время во всём мире отмечается неуклонный рост числа больных с заболеваниями печени. При этом различная печёночная патология в большинстве случаев сопровождается развитием серьёзных осложнений вплоть до появления печёночной недостаточности [1,2,3]. Несмотря на кажущуюся простоту определения ОПН, на практике диагностировать этот синдром непросто из-за зачастую сложной клинической картины, отсутствия явного отягощающего фактора, трудностей в дифференциальной диагностике с терминальной стадией болезни печени и определении необходимости и целесообразности конкретных терапевтических вмешательств. Диагностика ОПН основывается на данных анамнеза, клинической картине, биохимических изменениях [2,4,14].

Материалы и методы.

Для создания экспериментальной модели гепатоцеллюлярной недостаточности эксперименты были проведены на 110 крысах-самцах линии Вис тар массой 180-220гр. Проведено 3 серий экспериментов:

• 1.    Контрольная группа.

• 2.    После затравки в дозе 150 мг/100 гр массы внутрибрюшинным введением DL-галактозамина [5,6] (исследования через 12ч.,18ч.,24ч., и 48ч.).

• 3.    После затравки внутрибрюшинным введением 0,25 мл/100 гр

массы ССL4 [6,7,8] (исследования через 12ч.,18ч.,24ч., и 48ч.).

Животных забивали декапитацией в холодной комнате. Быстро извлекали печень, промывали и готовили гомогенат в среде, состоящей из 0,25 сахарозы, 2x10-4 М ЭДТА (этилендиаминтетраацетат); 0,01 М трис-НСL    буфера с рН 7,4 в соотношении ткани и среды 1:2.

Полярографический анализ проводили со стандартным платиновым электродом Кларка закрытого типа на полярографе LР-7 [9].

В полярографическую кювету объемом 1,1 мл. поочерёдно вносили гомогенат из расчёта 1-2 мг. белка, аскорбат натрия в конечной концентрации 2мМ, ТМДФ- [10] (тетраметиленпарафенилендиамин)-1 мкМ и цитохром-С-[11] 1 мкМ. Скорость дыхания выражали в нмоль О2/минут. мг. белка. Высчитывали прогностический коэффициент (ПК) по формуле: ПК = Цитохром С- Аскорбат Nа / ТМФД - Аскорбат Na

Взвесь ксеногенных гепатоцитов получали комбинированным методом Берри-Фриенд в модификации А.И. Арчакова[12]. Степень морфологической сохранности полученных гепатоцитов оценивали методом световой и фазово-контрастной микроскопии, с предварительной окраской витальным красителем - 0,2% трипановым синим. Цифровой материал обработан методом вариационной статистики [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Через 12 часов после затравки DL-галактозамином (табл.#1),

Таблица# 1.

Скорость потребления кислорода (в нмоль О2 мин-1 мг.белка) печени экспериментальных животных в различных метаболических состояниях

Период исследования	Аскорбат зависимое потребление О2	ТМФД-оксидазная активность	ЦитохромС-оксидазная активность
Контрольная группа	10,50±0,15	20,00±1,50	27,90±3,00
ДL-галактозамин, через (час):12	17,10±0,98*	21,90±1,10	41,80±3,50*
18	13,10±0,60*	17,00±0,60	40,01±1,16*
24	13,50±0,60*	15,90±0,60*	36,82±0,60*
48	13,00±0,40*	15,10±0,80*	39,01±4,43*
CСL4,через12 час	13,73±0,37*	21,90±0,41	73,20±3,03*
24	11,82±0,41	14,85±0,44	65,90±2,02*

Примечание :* - различия между показателями контрольной и опытной групп достоверны (Р<0,05).

полярографические исследования показали скорость аскорбат-зависимого потребления О2 возрастала на 62,8% (Р<0,05), в дальнейшем этот показатель постепенно снижается и к концу эксперимента это увеличение составляет лишь 23,8%. В отличие от неё ТМФД-оксидазная активность гомогената печени постепенно снижается (на 24,5% через 48 часов затравки). Цитохром-С оксидазная активность повышена статистически значимо на 30-50% во все сроки исследования.

Морфологическое исследование ткани печени выявило, что уже через 12 часов после затравки DL-галактозамином (рис.#1)- балочное строение печени несколько нарушено ,контуры гепатоцитов нечёткие.

Рис.#1. Очаговая вакуольная дистрофия гепатоцитов с перифокальной лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией через 12 часов после затравки DL-галактозамином . Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 200.

В паренхиматозных клетках наблюдаются обеднение ядер хроматином. Повсеместно встречаются рассеянные по паренхиме круглоклеточные инфильтраты с примесью лейкоцитов. Часто инфильтраты локализуются вблизи венозных сосудов.

С увеличением продолжительности времени от начала затравки (18 и 24 часа) эти изменения усугубляются, и к 48 часам (рис.#2) отражают наиболее тяжёлые повреждения: тотальные некробиотические изменения гепатоцитов.

Рис.# 2. Тотальные некробиотические изменения гепатоцитов через 48 часов после затравки DL-галактозамином. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 200.

Подсчёт количества жизнеспособных клеток печени показывает, что их количество с увеличением времени от начала затравки уменьшается. Так, через 12 часов количество жизнеспособных клеток составляет 50% а коэффициент 5,05, в то время как через 48 часов составляет 10-12% а коэффициент 13,2 (рис.#3).

Подсчёт количества жизнеспособных клеток печени показывает, что их количество с увеличением времени от начала затравки уменьшается. Так ,через 12 часов количество жизнеспособных клеток составляет 50% а коэффициент 5,05 ,в то время как через 48 часов составляет 10-12% а коэффициент 13,2рис.#3).

Соотношение Цит.С/ТМФА оксидазных активностей и процент жизнеспособных клеток при затравке Д-галактозамином в зависимости от продолжительности её

Рис.#3. Подсчёт количества жизнеспособных клеток печени после затравки DL-галактозамином (через 12,18,24 и 48 часов) и их соотношение с коэффициентом.

Наблюдения за этими животными показали, что тяжесть их клинического состояния увеличивается в зависимости от продолжительности времени после затравки. К 48 часам у животных отмечалась выраженная гиподинамия, кровоточивость, снижение болевой чувствительности с последующим наступлением гибели 100% животных.

У крыс, получавших ССL4, нами выявлена такая же динамика изменений скорости потребления О2 в различных метаболических состояниях. Отличительной особенностью данной модели от галактозаминового, была резкая активация цитохром С-оксидазы (табл.1) (превышение на 162,4 и 136,2 % значений интактных крыс через 12 и 24 часа от затравки). В группе с отравлением ССL4 было определенно

Рис.#4. Величина коэффициента после затравки ССL4 (через 12,18,24 и 48 часов).

• 12    часов после затравки величина коэффициента возрастает до 7,2 , а через 24 часа, когда наблюдалась гибель 50% животных – до 10,9. У выживших крыс в последующем через 36 и 48 часов величина коэффициента снижалась соответственно до 7,0 и 6,0.

Морфологические исследования ткани печени показали, что через 12 часов после затравки ССL4 (рис.#5) встречаются участки некрозов, мелкокапельная вакуолизация гепатоцитов, ожирение клеток по периферии долек.

Рис.#5. Встречаются участки некрозов, мелкокапельная вакуолизация гепатоцитов, ожирение клеток по периферии долек через 12 часов после затравки ССL4 . Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 200.

К 24 часам (рис.#6) эти изменения усугубляются и отражают наиболее тяжёлые повреждения: тотальные некробиотические изменения гепатоцитов.

Рис.#6. тотальные некробиотические изменения гепатоцитов через 24 часов после затравки ССL4 . Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 200.

А на 36 и 48 часу, в сохранившихся участках паренхимы некробиотические изменения гепатоцитов несколько уменьшаются, что соответствует уменьшению коэффициента и наблюдается некоторое улучшение состояния животных (активность, аппетит, опрятность..)

Подсчёт количества жизнеспособных клеток показал (рис.#7) , что через 12 часов после затравки сохраняется 30% интактных клеток,

/коэффициент 7,2/ ,а через 24 часа---15% / коэф.-10,9/.

Соотношение Цит. С/ТМФА оксидазных активностей и процент жизнеспособных клеток при затравке CCL4 в зависимости от продолжительности её

Коэф

Рис.#7. Подсчёт количества жизнеспособных клеток печени после затравки ССL4 (через 12 и 24 часа) и их соотношение с коэффициентом.

Клиническое состояние крыс постепенно ухудшается и к 24 часу достигает своего пика, когда отмечается гибель 50% животных. У выживших к 48 часу частично восстанавливается подвижность, активизируются рефлексы, появляется аппетит, уменьшается кровоточивость, а также несколько увеличивается количество жизнеспособных клеток.

Таким образом, результаты данной серии опытов показали, что используемый нами метод позволяет количественно оценить степень повреждения печёночной паренхимы при отравлении DL-галактозамином, и ССL4. Причём, наибольшая величина коэффициента соответствует наиболее выраженным морфологическим изменениям, количеству жизнеспособных клеток и тяжёлому клиническому состоянию животных.

ВЫВОДЫ:

• 1 .Использование данного теста может служить методом диагностики повреждения печени.

• 2 .Позволит количественно оценить сохранность паренхимы.

• 3 .Создаёт предпосылки для выбора диагностической, лечебной тактики в плане характера и обширности оперативного вмешательства и терапевтических методов коррекции.

• 4 . Определить дальнейшее течение и прогноз данного заболевания у больных.