Оценка остеоинтеграции коллагеновой мембраны при реконструкции связочного аппарата коленного сустава (экспериментальное исследование)



Связки суставов — это пучки плотной волокнистой соединительной ткани, стабилизирующие и ограничивающие, либо направляющие движение костей суставов. Их повреждение может серьезно нарушить стабильность сустава, и, как следствие, привести к разрушению внутрисуставных структур и нарушению его функции, что свою очередь значительно снижает качество жизни [1, 2].

На травмы связочного аппарата приходится 30 процентов от всех травм опорно-двигательного аппарата. Для решения данной проблемы на сегодняшний день разработаны и широко применяются многочисленные методы и материалы для реконструктивных операций, основанные на проведении пластики аутологичными тканями, ксено-, алло- и синтетическими трансплантатами [3]. Однако, все эти методы реконструкции, наряду с преимуществами, имеют и недостатки. Так, например, забор аутотрансплантата неминуемо является травмирующим фактором стороны забора, что может быть причиной боли. Недостатками аллотрансплантата и ксенотрансплантата являются потенциальный риск иммунного отторжения и передачи инфекций [4]. При применении синтетических материалов возможна потеря механической прочности со временем, недостаточная интеграция в ткани и ранние разрывы [5]. В последнее время тканевая инженерия стала многообещающим и наиболее актуальным направлением для преодоления перечисленных проблем [6]. Рост возможностей и актуальность создания структуры с биологическими и физико-механическими свойствами схожими со здоровой связкой отражает увеличение числа проводимых исследований в данной области. Несмотря на разнообразие исследуемых материалов, предложенных для тканевой инженерии связок и сухожилий, до применения в клинической практике они пока не дошли [8], что подтверждает необходимость дальнейшей доработки и оптимизации тканеинженерных каркасов связок и сухожилий до клинического применения [23].

Идеальный биологический каркас для реконструкции связок должен быть биосовместимым и биоразлагаемым, не только обеспечивая немедленную стабильность сустава, но и способствуя формированию ктуры подобной нативной связки и интегрироваться в кость в костных туннелях [18, 19].

Наиболее распространенным и очевидным выбором для тканевой инженерии (ТИ) связок и сухожилий является коллаген I типа, учитывая его преобладание в нативной ткани [9, 10-13]. Он образует соединительную ткань, на которой пролиферируют фибробласты [14, 15]. По этой причине коллаген был первым натуральным материалом каркаса, который использовался при реконструкции связок [14]. Очищенный коллаген, полученный из тканей животных, требует перекрестного связывания для удаления чужеродного антигена, предотвращения потенциальной передачи болезни, повышения его механической прочности и замедления скорости его деградации [16].

Коллаген применяется в различных формах, таких как мембраны, губки и филлеры. Из них большой интерес для хирургических нужд представляют мембраны, так как они обладают достаточными механическими свойствами [17]. Практически во всех сферах хирургии проводятся исследования по использованию коллагеновой мембраны для дальнейшего внедрения в клиническую практику, так, например в оториноларингологии, в стоматологии, в урологии и т.д. [24, 25, 26].

Целью данного исследования является оценить остеоинтеграцию коллагеновой мембраны при реконструкции передней крестообразной и наружной коллатеральной связок коленного сустава в эксперименте на животной модели.

Материалы и методыДизайн эксперимента.

В настоящем исследовании экспериментальной моделью являются кролики породы «советская шиншилла» весом 2,5-4,0 кг (возраст от 7 до 12 месяцев, 18 особей, самцы). Все методы в работе были выполнены в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Проведение работы регламентировано Приказом Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.1984 г., утвердившего «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных». Содержание животных осуществлялось в соответствии с требованиями ГОСТ P от 02.12.2009 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)». Кормление животных проводилось по нормативам в соответствии с видом животного, без специализированного корма (например, содержащего добавки для стимуляции регенерации).

Всем особям выполнено оперативное вмешательство – реконструкция передней крестообразной (ПКС) и наружной коллатеральной связок (НКС) коленного сустава. В зависимости от сроков выведения из эксперимента сформированы

3 группы: I группа – 15 дней (6 особей), II группа– 30 дней (6 особей), III группа – 60 дней (6 особей). Число животных в каждой группе – 18 штук.

В качестве материала для реконструкции была использована коллагеновая мембрана, созданная в Институте регенеративной медицины Сеченовского Университета. Изделие представляет собой мембрану из коллагена 1 типа, полученного из связок крупного рогатого скота. Химически сшитое при помощи глутарового альдегида. Размеры мембраны – 15х4х0.3 см в сухом виде (могут быть скорректированы интраоперационно). Мембрана прошла физико-химические и биологические испытания in vitro и in vivo [22].

По истечении указанного срока, животные выводились из эксперимента путем медикаментозной эвтаназии летальной дозой ксилазина гидрохлорида. Забор экспериментального сегмента (коленный сустав) проводился путем высокой резекцией бедренной кости и низкой резекции костей голени для предотвращения повреждения коллагенового имплантата. Макропрепарат выделялся со всеми слоями мягких тканей.

Морфологический анализ образцов коллагеновой мембраны, имплантированной в туннели большой берцовой и бедренной костей, а также в мягкие ткани проводился для каждого срока выведения животного из эксперимента в соответствии с выбранной группой (I, II, III) .

Этапы анализа образцов:

• 1. Фиксированные в 10% нейтральном забуференном формалине ткани декальцинировали в течение 3 недель, после чего заливали в парафиновые блоки.

• 2.    Срезы толщиной 4-5 микрометров окрашивали гематоксилином и эозином, сафранином О / Fast Green и пикросириусом красным, после чего исследовали с помощью универсального микроскопа LEICA DM4000 B, оснащенного видеокамерой LEICA DFC7000 T. Работа камеры под управлением программного обеспечения LAS V4.8 (Leica Microsystems, Германия).

• 3.    Образцы изучали методами стандартной оптической и фазово-контрастной микроскопий. Фотографии при малом увеличении получали с использованием USB микроскопа Bresser.

• 4.    Статистический анализ экспериментальных данных проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.00 для Windows (GraphPad Software, США). Различия оценивали с помощью теста Краскела-Уоллиса с тестом множественного сравнения Данна. P-значения ≤0,05

В каждом препарате оценивались морфологические признаки регенерации и воспаления в зонах фиксации и прохождения имплантата в большой берцовой и бедренной костях (резорбция, разрыхление имплантата, краевая воспалительная реакция, инфильтрация толщи имплантата, фиброзная капсула вокруг имплантата, регенерация кости вокруг имплантата), а также в окружающих имплантат тканях, коже и мышцах (резорбция, разрыхление имплантата, краевая воспалительная реакция, инфильтрация толщи имплантата, фиброзная капсула вокруг имплантата) по 5-балльной шкале (0 - нет, 4 - максимальная интенсивность).

считались статистически значимыми. Результаты статистического анализа были представлены в виде графов соединенных медианных значений и 95% ДИ.

Хирургический протокол.

Эксперимент по реконструкции ПКС и НКС проводили в асептических условиях. После индукции спинальной анестезии раствором Лидокаина 3% коленный сустав правой задней конечности подвергали медиальной парапателлярной артротомии. Производился латеральный вывих надколенника с последующей визуализацией структур коленного сустава и повреждение скальпелем ПКС в месте ее прикрепления к бедренной кости. Затем, выполнялось формирование трёх сквозных костных тоннелей диаметром 2,0 мм для проведения коллагенового имплантата (туннель №1- медиальная поверхность проксимального метаэпифиза большеберцовой кости; туннель №2 - медиальная поверхность латерального мыщелка бедренной кости; туннель №3 - проксимальный отдел большеберцовой кости (дистальнее тоннеля №1), рисунок 1б). После рассверливания через все тоннели последовательно была проведена лигатура-проводник и устанавливался во все тоннели последовательно коллагеновый имплант толщиной 1 мм, шириной 3 мм и длинной 70 мм, имплантат был промеделирован в необходимые размеры инстраоперационно. Таким образом, часть коллагенового импланта находиласть интраартикулярно, а часть — экстра-артикуляно. Оставшиеся снаружи тоннелей свободные концы импланта сшивались между собой отдельными узловыми швами (Рисунок 1а). Разрезы ушивали послойно.

Рисунок 1. а) этапы хирургической операции; б) Схема костных туннелей.

Послеоперационный период.

После выведения из анестезии животных помещали в предварительно маркированную клетку.

Мониторинг и динамика заживления послеоперационных ран выполнялись при перевязках. Перевязки проводились с применением растворов антисептиков, ежедневно в первые 4 суток после операции, далее через день, в течение 12 суток после операции. В течение первых 4-х суток после операции всем особям проводилась анальгетическая терапия, с применением метамизола натрия 50% по 0,4 мл подкожно, и антибактериальная терапия антибиотиками широкого спектра действия (цефтриаксон в растворе прокаина 5%). Оценивалось общее состояние особей, а также проводился физикальное обследование коленного сустава в течение всего периода наблюдения.

Результаты эксперимента.

В послеоперационном периоде инфекционных осложнений не наблюдалось, умеренный отек мягких тканей области операции сохранялся не более 4-х недель после операции и не наблюдался более ни у одной особи на всех остальных точках контроля. У всех особей в послеоперационном периоде отмечалась удовлетворительная стабильность коленного сустава, а объем активных и пассивных движений соответствовал нормальному диапазону.

Результаты морфологического исследования.

Группа I (15 суток после имплантации).

Вокруг имплантата формируется соединительнотканная капсула разной толщины и зрелости в разных образцах, которая состоит из продольно ориентированных коллагеновых волокон и фибробластов между ними (рис. 2 а, б). Следует отметить, что рядом с капсулой имплантата наблюдается костная регенерация: формируются длинные тонкие костные трабекулы с остеобластами и большим количеством остеоцитов (рис. 2 в, г). На данном сроке отмечается хороший уровень резорбции имплантата – примерно 1/3 его резорбирована.

Рисунок 3. Коллагеновый имплантат в туннеле кости. 15 суток после операции. а) Общий вид эпифиза б/б кости. Сверху под суставным хрящом и слева у основания головки видны округлые фрагменты имплантата. Увеличение 30x; б) Справа находится участок имплантата в процессе резорбции, слева оставшиеся и новообразованные костные трабекулы.

Стандартная световая микроскопия, увеличение 50x;

• в)    Справа видна новообразованная костная трабекула, под ней находится фиброзная капсула имплантата, а ближе к центру начинается краевая зона имплантата с разрыхлением коллагеновых волокон и их клеточной инфильтрацией. Стандартная световая микроскопия, увеличение 200x;

• г)    Тот же участок при фазово-контрастной микроскопии, увеличение 200x.

Группа II (30 суток после имплантации).

Через 30 суток после операции интенсивность резорбции имплантата в туннеле кости усиливается - он резорбирован больше, чем на половину (рис. 4 а, б).

Рисунок 4. Коллагеновый имплантат в туннеле кости. 30 суток после операции. а) Общий вид имплантата в туннеле б/б кости.

Увеличение 30x; б) Активно резорбируемый коллагеновый имплантат, окруженный новообразованными костными трабекулами.

Стандартная световая микроскопия, увеличение 50x;

Группа III (60 суток после имплантации).

Через 60 суток после операции имплантат в туннеле кости практически полностью резорбирован (рис. 5 а, б). Имплантат окружен тонкой фиброзной капсулой, краевая и центральная зоны имплантата уже не выявляются, в имплантате остаются лишь небольшие фрагменты разрыхленных коллагеновых волокон, интенсивно резорбируемых многочисленными гигантскими многоядерными клетками и макрофагами, усиливается прорастание фибробластами (рис. 5 в-ж). Вокруг имплантат также отмечаются участки регенерации костных трабекул (рис. 5 з).

Рисунок 5. Коллагеновый имплантат в туннеле кости. 60 суток после операции. а) Общий вид имплантата в туннеле б/б кости. Увеличение 30x; б) Почти полностью резорбированный имплантат с остатками коллагена эозинофильного цвета. Стандартная световая микроскопия, увеличение 50x; в) Краевая зона имплантата с интенсивным разрыхлением коллагеновых волокон и их резорбцией макрофагами и гигантскими многоядерными клетками. Стандартная световая микроскопия, увеличение 200x; г) Тот же участок при фазово-контрастной микроскопии, увеличение 200x.

• д)    Центральная часть имплантата с оставшимися фрагментами коллагена эозинофильного цвета, активно резорбируемыми гигантскими многоядерными клетками и макрофагами. Стандартная световая микроскопия, увеличение 200x; е) Тот же участок при фазово-контрастной микроскопии, увеличение 200x. ж) Скопление гигантских многоядерных клеток и макрофагов в толще имплантата. Стандартная световая микроскопия, увеличение 400x;

• з)    Регенерация костных трабекул вокруг имплантата. Стандартная световая микроскопия, увеличение 200x. Окраска гематоксилин-эозином.

  
  
  
  
  
  

Рисунок 6. Коллагеновый имплантат в туннелях кости на ПОД15 (а,б), ПОД30 (в,г), ПОД60 (д,е), стандартная оптическая (а,в,д) и поляризационная (б,г,е) микроскопии. Снижение интенсивности и усиление дискретности окрашивания (анизотропии в поляризованном свете) пикросириусом красным коллагеновых волокон имплантата может свидетельствовать об усилении разволокнения и резорбции имплантата с увеличением временных сроков наблюдения в большой берцовой кости. При этом структура и анизотропия окружающих имплантат костных трабекул существенно не меняется.

Заключение

После имплантации коллагеновой мембраны в костные туннели происходят активные процессы клеточной инфильтрации и резорбции имплантата. В костной ткани через 15 суток после операции имплантат ещё достаточно плотный, окружен фиброзной капсулой, под которой располагается полоса клеточной инфильтрации, состоящая преимущественно из лимфоцитов и макрофагов. На этом сроке в краевой зоне имплантата происходит разрыхление коллагеновых волокон, их клеточная инфильтрация и резорбция, тогда как в плотную центральную часть имплантата только начинают прорастать немногочисленные макрофаги и фибробласты. Через 30 суток процессы клеточной инфильтрации и резорбции имплантата усиливаются и достигают максимума до полного разрыхления и резорбции коллагеновых волокон имплантата через 60 суток после операции. Следует отметить, что резорбция имплантата идет гораздо интенсивнее в большой берцовой кости, чем в бедренной кости. Также на всех сроках в костной ткани вокруг имплантата отмечается регенерация костных трабекул, что говорит о хорошей способности имплантата к остеоинтеграции. Патологических изменений в окружающих имплантат тканях не выявлено ни на одном временном сроке, что говорит о хорошей биосовместимости имплантированного материала.

Обсуждение.

Проблема остеоинтеграции трансплантатов, применяемых для реконструкции связочного аппарата на сегодняшний день является одной из часто анализируемых. Представленные в клинической практике синтетические материалы обладают низкой биосовместимостью и способностью к остеоинтеграции [20]. Ключевыми компонентами успешной остеоинтеграции на границе сухожилия и кости являются биосовместимый каркас, подходящий к поверхности кости, клетки-предшественники и остеоиндуктивные факторы [21]. Природные полимеры более биосовместимы, биоразлагаемы, обладают лучшими характеристиками остеоинтеграции и стимулируют образование новых тканей, что увеличивает их потенциал при реконструктивных операциях[8].

В мировой литературе описаны много исследований по оценке остеоинтеграции различных биополимеров. Так например, Fanggang B et. исследовали шелко-коллагеновый каркас с гидрооксиапатитом для реконструкции ПКС на животной модели. Данные морфологического исследования показали массивное образование более зрелой кости на границе сухожилия и кости, а иммуногистохимическое окрашивание выявило большее отложение коллагена I и остеокальцина. Однако оценка заживления проводилась только в одной временной точке, что не позволило оценить восстановление и ремоделирование на протяжении всего процесса остеоинтеграции [21].

Целью настоящего экспериментального исследования являлось оценить остеоинтеграцию коллагеновой мембраны при реконструкции передней крестообразной и наружной коллатеральной связок коленного сустава в эксперименте на животной модели. Показано, что после имплантации коллагеновой мембраны в туннели бедренной и большеберцовой костей происходят активные процессы клеточной инфильтрации и резорбции имплантата. На всех сроках в костной ткани вокруг имплантата отмечается умеренная регенерация костных трабекул. Патологических изменений в окружающих имплантат тканях не выявлено ни на одном временном сроке, что говорит о хорошей остеоинтеграции и биосовместимости имплантированного материала. Полученные результаты дают основание предполагать, что применение данного материала для реконструкции связочного аппарата является перспективным. В дальнейшем нами планируется продолжение исследования свойств коллагенового трансплантата на более поздних сроках после его имплантации.