Оценка перспективных линий кукурузы (Zea mays L.) по содержанию хлорофиллов и экспрессии генов PSAA и PSBА для селекции гибридов кормового направления

Кукуруза ( Zea mays L.) — ключевая продовольственная культура, которая также занимает одно из ведущих мест среди кормовых растений. Силосная кукуруза, специально выведенная для использования в качестве кормовой культуры, имеет легкоусвояемые волокна в сочетании с высоким содержанием крахмала и сахара, необходимыми для правильного силосования.

Силосная кукуруза может давать высокие урожаи биомассы с высокими показателями валовой энергии и служит ценным кормом для жвачных животных. Повышение ее питательной ценности — один из важных факторов, способствующих улучшению кормопроизводства и потенциальному повышению продуктивности животноводства (1).

В Российской Федерации ведутся исследования по созданию новых гибридов кукурузы, адаптированных к различным климатическим условиям и обладающих высокой урожайностью (2). Кроме того, хоть и с меньшей интенсивностью, изучаются вопросы консервирования и хранения кукурузного силоса, оценивается его качество и питательная ценность для силосования (3). За рубежом, особенно в США и Европе, в последние десятилетия значительное внимание уделяется созданию гибридов кормовой кукурузы с улучшенными характеристиками, в частности с высоким выходом вегетативной массы в сочетании с повышенной питательной ценностью (1).

Первоначально предполагалось, что генотипы кукурузы с высокой урожайностью зерна также дают высокий урожай биомассы. Однако исследования показали, что увеличенная силосная масса не достигается при высокой продуктивности зерна, поскольку физиология гибридов кукурузы на силос отличается от таковой у зерновой кукурузы (1). При этом прирост вегетативной массы коррелирует с содержанием хлорофилла (4).

В хлоропластах высших растений присутствуют два типа хлорофиллов — хлорофилл a и хлорофилл b. Основной пигмент фотосинтеза — хлорофилл a улавливает фотоны и передает их к реакционным центрам фотосистем I и II, тогда как хлорофилл b служит вспомогательным пигментом, ответственным за передачу световой энергии хлорофиллу a. Эффективность работы фотосистем растений, в частности кукурузы, во многом определяется экспрессией генов, кодирующих ключевые компоненты фотосинтетического аппарата, прежде всего хлорофиллы (5). Среди этих генов особое значение имеют гены psaA и psbA , кодирующие белки реакционных центров соответственно фотосистем I и II. Ген psaA кодирует белок PsaA, один из основных компонентов реакционного центра фотосистемы I (6), тогда как ген psbA кодирует белок D1 — ключевой компонент реакционного центра фотосистемы II (7). Изменения в экспрессии этих генов могут оказывать значительное влияние на эффективность фотосинтеза и, как следствие, на продуктивность растений.

Химическая структура обоих хлорофиллов включает порфириновое кольцо с центральным ионом магния и присоединенную сложноэфирной связью длинную углеводородную фитильную цепь (8). Измерение содержания хлорофилла используется для определения физиологического состояния растений, оценки воздействия стрессовых факторов и прогнозирования продуктивности для различных сельскохозяйственных культур. Выявлено что содержание хлорофилла положительно соотносилось с урожайностью и стрессоустойчивостью (8-10). Кроме того, не только общее содержание хлорофиллов, но и соотношение хлорофиллов a и b может изменяться в зависимости от вида растений, условий роста и развития, обеспечивая наилучшую адаптацию к окружающей световой среде (11). Установлено, что в процессе адаптации растений к засухе и жаре соотношение хлорофилла a и b уменьшается (12). Определение этого соотношения в линиях кукурузы может послужить инструментом для изучения механизмов их адаптации к экстремальным условиям, а также для разработки стратегий повышения урожайности и устойчивости к засухе.

Помимо значимости для растений, совокупные результаты исследований in vitro и in vivo с использованием нативных хлорофиллов указывают на их потенциальную пользу для здоровья млекопитающих (13-15). При этом не только сам хлорофилл, но и его производные — фитол и фитановая кислота положительно влияют на здоровье, увеличивая мышечную массу, улучшая жировой обмен и развитие животных (16-18). Так, у коров, которых в течение 3 мес кормили травяным силосом, значительно (до 0,69 % от массы жира) увеличивалось содержание фитановой кислоты (19). Количество фитановой кислоты напрямую зависит от содержания фитолов и, соответственно, хлорофилла в кормах (15). В связи с этим обеспечение жвачных животных кормами с более высоким содержанием хлорофилла положительно повлияет на их здоровье и качество продукции.

В представленной работе среди селекционных линий кукурузы из коллекции Института сельского хозяйства — филиала ФГБНУ ФНЦ Кабардино-Балкарского научного центра РАН (ИСХ КБНЦ РАН) впервые выявлены восемь образцов с высоким накоплением хлорофиллов в листьях, которые могут быть рекомендованы в качестве материала для селекции гибридов на высокую продуктивность и улучшенные кормовые характеристики, а также показана взаимосвязь между количеством общих хлорофиллов и экспрессией генов фотосистем, в частности транскрипцией генов psaA и psbA .

Целью нашего исследования стала оценка содержания хлорофилла a и хлорофилла b в перспективных селекционных линиях кукурузы для выделения образцов кормовой направленности с повышенным содержанием хлорофиллов, а также определение возможных корреляций между содержанием хлорофиллов и экспрессией генов psaA и psbA .

Методика . Для анализа отобрали 150 селекционных линий кукурузы из коллекции ИСХ КБНЦ РАН, используемых для получения сортов и гибридов зернового и универсального направлений. Растения выращивали на опытных участках ИСХ КБНЦ РАН (43,628604 ° N, 44,135084 ° W) в 2023 году.

Содержание хлорофиллов а и b в листовой ткани определяли с использованием реактива Фолча (20) (спектрофотометр УФ-1100, «Эковью», Россия). Для этого через 5-6 сут после опыления отбирали около полудня листья пятого яруса у второго растения в ряду, чтобы свести к минимуму потенциальное влияние интенсивности света на функциональную актви-ность хлоропластов. Для каждой линии были отобраны листья с трех растений (с одного растения из каждого из трех рядов делянки, всего три биологические повторности). Листовые диски вырезали с середины листа, избегая средних жилок, гомогенизировали в жидком азоте и замораживали при - 80 ° C для последующего анализа методом Фолча. Все измерения проводились в трех аналитических повторностях.

Экспрессию psaA и psbA определяли в тех же гомогенизированных в жидком азоте тканях, для которых измеряли содержание хлорофиллов. Из 50 мг листовой ткани выделяли суммарную РНК (RNeasy Plant Mini Kit, «QIAGEN N.V.», Германия), очищали от примесей ДНК (RNase-free DNase set, «QIAGEN N.V.»,Германия). Качество мРНК проверяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле, количество измеряли флуориметрически (Qubit® Fluorometer, «Thermo Fisher Scientific», США). Полученные препараты мРНК использовали для синтеза кДНК с праймером oligo-dT (GoScript Reverse Transcription System, «Promega», США) согласно рекомендации производителя.

Экспрессию генов оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) в двух биологических и трех аналитических повторностях на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad Laboratories», США). В реакции использовали 3,0 нг кДНК и смесь для РВ-ПЦР в присутствии SYBR Green (НПК «Синтол», Россия), а также прай- меры psaA-F 5´-CCACCCCAGCGTCAAGAA-3´, psaA-R 5´-TGAATCACC-ACTTAGCGGGATT-3´, psbA-F 5´-GCTGCCCCTCCAGTAGATATTG-3´, psbA-R 5´-AACAGATGCAGCTTCCCAAATT-3´. Условия реакции были следующими: 5 мин при 95 °С (денатурация); 15 с при 95 °С (денатурация), 40 с при 60 °С (отжиг/синтез цепи) (40 циклов). Для нормализации данных РВ-ПЦР использовали референсный ген ZmUbi (NM_001329666.1; праймеры ZmUBI-rtF: 5´-ATCGTGGTTGTGGCTTCGTTG-3´, ZmUBI-rtR: 5´-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3´).

Результаты биохимических исследований обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel 2013. Для содержания общих хлорофиллов, хлорофилла a и хлорофилла b рассчитывали средние по формулам для двухфазной экстракции Фолча и стандартные отклонения (±SD) (20). Статистический анализ включал построение точечной диаграммы, выявление линейной зависимости методом наименьших квадратов и определение величины коэффициента детерминации R2 с применением встроенных функций регрессионного анализа и инструментов визуализации Microsoft Excel. Данные анализа экспрессии генов статистически обрабатывали с помощью программы Graph Pad Prism v. 9 , США).

Результаты . У 150 инбредных линий кукурузы из коллекции ИСХ КБНЦ РАН суммарное содержание хлорофиллов в листьях составляло от 127,25 до 871,99 мкг/г.

По количеству хлорофиллов в листьях линии значительно различались, и их можно было объединить в три группы: с высоким (> 400 мкг/г) (21 образец), средним (200-400 мкг/г) (91 образец) и низким (< 200 мкг/г) (38 образцов) содержанием (рис. 1). При этом выявленное максимальное количество хлорофиллов (образец 726; 871,99 мкг/г) и их минимальное количество (образец 804; 127,25 мкг/г) значительно (в 6,85 раза) различалось.

Полутора-двукратный разброс в содержании хлорофиллов отмечали у многих сельскохозяйственных растений, но при этом в большинстве случаев число анализируемых образцов не превышало двадцати (9, 10). Так, при анализе 10 линий кукурузы содержание общих хлорофиллов в листьях различалось в 2,1 раза (10). В нашем случае, если сравнивать суммарное количество хлорофиллов в наиболее представительной группе с их средним содержанием (91 образец), то разница между минимальным и максимальным показателем также была не более чем 1,8-кратной.

Практический интерес для селекции силосной кукурузы представляют идентифицированные нами линии, в которых содержание общего хлорофилла значительно превышало средние значения.

Помимо общего хлорофилла, у 150 образцов кукурузы мы сравнили содержание хлорофилла a и хлорофилла b, а также количественное соотношения этих двух пигментов. Содержание хлорофилла а в листьях у анализируемых образцов колебалось от 88,95 до 608,95 мкг/г, хлорофилла b — от 38,3 до 270,36 мкг/г (см. рис. 1).

Эти значения в целом совпадали с ранее полученными для кукурузы (21, 22). Как и ожидалось, средние концентрации хлорофилла a были выше в сравнение с хлорофиллом b, что соответствовало результатам, полученным в других работах (23, 24), и согласуется с известной ролью этих пигментов в процессе фотосинтеза (25).

Интерес представляют не только значения концентрации пигментов, но и их относительное содержание. Соотношение хлорофилла a и хлорофилла b служит показателем состояния фотосистем и светособирающих комплексов, а также адаптивности растения (12).

КБНЦ РАН. Звездочкой отмечены линии, отобранные для анализа генной экспрессии ( n = 3, N = 3, M ±SD; опытное поле ИСХ КБНЦ РАН, с. Опытное, Терский р-н, Кабардино-Балкар

ская Республика, 2023 год).

В нашем исследовании величина соотношения хлорофилл a/хлоро-филл b у разных линий кукурузы варьировала от 1,72 до 2,65. Результаты в целом совпали с ранее полученными данными, где было показано, что значения этого показателя для анализируемых образцов кукурузы составили в среднем 2,7 (21, 25). Однако в работе H.K. Lichtenthaler с соавт. (26) приведены большие значения: у кормовой кукурузы соотношение хлорофиллов составляло в среднем 3,9, у сахарной — 4,5. Такое различие может иметь как генетическую основу, так и быть результатом разных условий произрастания и разных фаз развития исследуемых растений.

Точечная диаграмма, созданная на основе данных по концентрациям хлорофиллов a и b, позволяет визуализировать связь между этими важными пигментами (рис. 2). Линия тренда с коэффициентом детерминации R2 = 0,9781 подчеркивала значительную корреляцию между содержанием хлорофиллов a и b и показала, что лишь незначительная доля вариаций концентрации одного пигмента не обусловлена изменениями концентрации другого. Данные нашего исследования подтверждают тот факт, что увеличение аккумуляции хлорофилла a чаще всего сопровождается увеличением количества хлорофилла b, и это отражает их координированное участие в фотосинтетических процессах (27).

Рис. 2. Взаимосвязь между содержанием хлорофилла а и хлорофилла b в листьях у 150 линий кукурузы ( Zea mays L.) из коллекции ИСХ КБНЦ РАН (опытное поле ИСХ КБНЦ РАН, с. Опытное, Терский р-н, Кабардино-Балкарская Республика, 2023 год).

Сравнивая полученные результаты с данными исследований по другим видам растений, можно отметить, что соотношение хлорофиллов a и b у кукурузы в нашем эксперименте (1,72-2,65, среднее 2,22) находилось в пределах значений, характерных для большинства злаковых сельскохозяйственных культур. Например, в случае мягкой пшеницы это соотношение составляло 2,5, у ячменя — 2,19, у риса — 2,13 (28-30).

Чтобы определить, связаны ли детектируемые нами различия в содержании хлорофилла в листьях линий кукурузы с различиями в транскрипции генов фотосинтеза, методом ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) был проведен анализ экспрессии генов psaA и psbA , кодирующих ключевые белки реакционных центров фотосистем (31). Для анализа отобрали две линии с высоким содержанием общих хлорофиллов в листьях (линии 944 и 726) и две — с низким (линии 804 и 849) (рис. 3). Общее содержание хлорофиллов у линий 726 (871,99 мкг/г) и 944 (831,31 мкг/г) было одним из наиболее высоких в анализируемой выборке и в 5,4 раза превышало показатель у линий 804 (127,25 мкг/г) и 849 (184,14 мкг/г).

Установлено, что содержание хлорофиллов коррелировало с экспрессией обоих генов фотосистем. При этом у линий 726 и 944 уровень 978

транскрипции гена psaA превышал аналогичный показатель у линий 804 и 849 в 5,8 раза, а гена psbA — в 4,6 раза (см. рис. 3). Следует отметить, что экспрессия гена psaA в листьях всех линий кукурузы была в среднем в 1,5 раза выше, чем psbA. Такая же разница в экспрессии этих двух генов показана ранее для листьев горчицы (32).

Рис. 3. Результаты РВ-ПЦР анализа экспрессии генов psаA (А) и psbA (Б) в листьях образцов кукурузы ( Zea mays L.) из коллекции ИСХ КБНЦ РАН, контрастных по содержанию хлорофиллов а и b (линии 944, 726 — с высоким содержанием, линии 804,849 — с низким содержанием) (референсный ген — ZmUbi ; n = 2, N = 3, M ±SD; растения выращены на опытном поле ИСХ КБНЦ РАН, с. Опытное, Терский р-н, Кабардино-Балкарская Республика, 2023 год).

Таким образом, по результатам проведенного нами анализа у 150 сортов и инбредных линий кукурузы из коллекции ИСХ КБНЦ РАН выявлена значительная вариабельность в содержании хлорофиллов а и b. На основании полученных данных выделены три группы линий кукурузы с высоким (> 400 мкг/г), средним (200-400 мкг/г) и низким (< 200 мкг/г) содержанием хлорофиллов в листьях. Показано, что один из основных факторов, приводящих к повышенному синтезу хлорофиллов у линий кукурузы, — увеличение транскрипции двух ключевых генов фотосинтеза psaA и psbA. Выделены линии (726, 728, 760, 847, 935, 944, 2193, 8007) с высоким содержанием хлорофиллов, которые могут послужить основой для селекции гибридов кукурузы с высокой продуктивностью и улучшенными кормовыми характеристиками.