Оценка перспективных линий кукурузы (Zea mays L.) по содержанию каротиноидов и экспрессии ключевых генов каротиногенеза для селекции гибридов кормового направления

* Работа выполнена в рамках Федерального проекта «Аграрная наука — шаг в будущее развитие агропромышленного комплекса», направление 4.1.1.

Кукуруза ( Zea mays L.) — одна из основных зерновых культур и важнейшая кормовая культура. Повышение ее питательной ценности способствует стабилизации кормопроизводства и продуктивности животноводства (1). Однако большинство сортов и линий кукурузы характеризуются невысоким содержанием каротиноидов как в эндосперме зерна, так и в вегетативной массе, что ограничивает ее ценность, в том числе как кормовой культуры (2). В связи с этим селекция кукурузы с повышенным содержанием каротиноидов, особенно провитаминных форм, представляет собой актуальное направление исследований (3).

В настоящее время для эффективного увеличения питательной ценности кормовой кукурузы в дополнение к традиционной селекции используется биофортификация — процесс повышения содержания микронутриентов в растениях посредством биохимических и молекулярных методов (4).

У растений каротиноиды задействованы во многих клеточных процессах. Одна из основных функций каротиноидов — участие в фотосинтезе. Они служат вспомогательными светособирающими пигментами, которые посредством передачи энергии в синглетном состоянии эффективно расширяют диапазон света, поглощаемого фотосинтетическим аппаратом (5). Другие функции — гашение и поглощение образующихся в хлоропластах триплетного хлорофилла и других токсичных форм кислорода, которые могут вызывать окислительное повреждение белков, липидов и пигментов фотосинтетического аппарата, а также участие в рассеивании избыточной энергии (5-7). Кроме того, каротиноиды играют важную роль в формировании и стабилизации клеточных структур (8). Будучи основой для синтеза одного из наиболее важных фитогормонов — абсцизовой кислоты, они опосредованно обеспечивают антистрессовую защиту растений (5).

Фитоинсинтаза, кодируемая генами PSY1 и PSY2 , считается одним из ключевых ферментов каротиногенеза и катализирует реакцию конденсации двух молекул геранилгеранилдифосфата с образованием фитоина, который служит субстратом для синтеза всех остальных каротиноидов (9). Анализ генома многих растений показал присутствие трех гомологичных генов PSY.

В процессе эволюции различные паралоги PSY приобрели тканеспецифические модели экспрессии и подверглись субфункционализации для тонкой регуляции биосинтеза каротиноидов в онтогенезе и в ответ на факторы окружающей среды (10). PSY2 служит основным геном, экспрессирующимся в фотосинтетических тканях; PSY1 отвечает преимущественно за синтез и накопление каротиноидов в запасающих органах; PSY3, как было показано для кукурузы, регулирует биосинтез абсцизовой кислоты в корнях в условиях абиотического стресса или микоризного симбиоза (11-14). При этом у большинства растений, в том числе кукурузы, синтез каротиноидов в вегетативной ткани контролируется как геном PSY2 , так и геном PSY1 , в отличие, например, от томатов, у которых в листовой ткани экспрессируется только ген PSY2 (15). Таким образом, гены PSY считаются одними из главных регуляторов скорости биосинтеза каротиноидов, и их экспрессия напрямую влияет на общее накопление этих пигментов в клетках (16, 17).

После образования фитоина происходит серия реакций десатурации, ведущих к формированию ликопина — центрального соединения каротиноидного пути и предшественника различных каротиноидов; его дальнейшая трансформация определяет разнообразие синтезируемых пигментов (18, 19). Циклизация ликопина осуществляется двумя ферментами: ликопин в-циклазой (LcyB) и ликопин s-циклазой (LcyE), кодируемыми соответственно генами LcyB и LcyE, (20). LcyE участвует в синтезе а-каротина посредством формирования е- и в-колец, тогда как LcyB катализирует образование в-каротина через добавление в-колец с обеих сторон ликопина с дальнейшим образованием ксантофиллов (18, 20). Соотношение активности этих ферментов влияет на качественный и количественный состав накапливаемых каротиноидов и их провитаминную активность (21).

Каротиноиды — важные микронутриенты в рационе человека и животных, поскольку они не только служат сильными антиоксидантами, но и превращаются в организме в витамин А (ретинол) посредством окислительного расщепления (22). Потребность животных и человека в витамине А может быть удовлетворена за счет либо готового витамина А, либо каротиноидов с активностью провитамина А ( в -каротина).

Каротиноиды, в том числе провитамин А, необходимы для нормального развития и функционирование зрительной, иммунной и репродуктивной систем, а также для поддержания целостности эпителиальной ткани млекопитающих (23). Так, у крупного рогатого скота в -каротин поддерживает репродуктивную функцию на молекулярном уровне, особенно в лютеиновую фазу, защищая ферменты, связанные с выработкой половых стероидных гормонов, за счет своих антиоксидантных свойств (24). Это особенно важно в молочном животноводстве, где высокая продуктивность тесно связана с эффективностью воспроизводства стада.

Использование силосной кукурузы с повышенным содержанием каротиноидов представляет особый интерес для животноводства (25). Такой корм не только обеспечивает животных необходимой энергией и питательными веществами, но и обогащает рацион полезными микронутриентами/ан-тиоксидантами, что положительно сказывается на их здоровье и продуктивности (26). Кормление крупного рогатого скота силосом, богатым каротиноидами, способствует улучшению функций иммунной системы, снижает заболеваемость и улучшает общее состояние организма (27). Включение в рацион силоса с высоким содержанием каротиноидов отражается также на качестве продукции животноводства. Мясо и молоко животных, получавших такой корм, характеризуются повышенной питательной ценностью и улучшенными органолептическими свойствами. Например, в молоке увеличивается содержание в -каротина, за счет чего улучшаются его антиоксидантные свойства, и оно приобретает более насыщенный цвет (28-30).

Применение силоса с повышенным содержанием каротиноидов может привести к снижению необходимости использования синтетических витаминных добавок в рационах. Это способствует уменьшению затрат на кормление и делает продукцию более натуральной, экологически чистой и привлекательной для потребителей (31). Получены данные о том, что каротиноиды могут влиять на устойчивость животных к стрессовым факторам, улучшая адаптивные способности и повышая выживаемость молодняка (32). Это открывает дополнительные перспективы для использования, обогащенного каротиноидами силоса в условиях интенсивного животноводства.

Использование в селекции линий с повышенным содержанием каротиноидов обеспечит создание гибридов кукурузы с высокой питательной ценностью и свойствами, которые будут способствовать улучшению здоровья животных за счет повышения антиоксидантного статуса их организма и укрепления иммунной системы (4, 33). Поэтому селекция кукурузы с высоким содержанием каротиноидов как в зерне, так и вегетативной массе имеет потенциал для повышения эффективности животноводства и улучшения качества продукции, что делает исследования в этой области актуальными и востребованными (27).

Использование биохимических и молекулярных методов исследования вариабельности содержания каротиноидов в различных селекционных линиях кукурузы позволяет выявить генотипы с повышенной способностью к синтезу и накоплению этих соединений (33). Определение содержания каротиноидов и экспрессии ключевых генов их биосинтеза, таких как PSY1 , PSY2 , LcyB и LcyE , помогает понять механизмы регуляции этого процесса и разработать стратегии для повышения содержания каротиноидов в зерне и в вегетативной массе (34).

В представленном исследовании в коллекции Института сельского хозяйства — филиала ФГБНУ ФНЦ Кабардино-Балкарский научный центр РАН (ИСХ КБНЦ РАН) были впервые выявлены селекционные линии кукурузы с высоким содержанием каротиноидов в листьях, а также показана взаимосвязь между их накоплением и экспрессией ключевых генов кароти-ногенеза.

Целью работы стало определение содержания каротиноидов и экспрессии ключевых генов каротиногенеза в селекционных линиях кукурузы ИСХ КБНЦ РАН для выделения образцов, которые будут использоваться в селекционной работе для получения новых сортов и гибридов кормовой направленности.

Методика. Для анализа были отобраны 150 селекционных линий кукурузы ( Zea mays L.) из коллекции ИСХ КБНЦ РАН, которые используются для получения сортов и гибридов зернового и универсального назначения. Растения выращивали на опытных участках ИСХ КБНЦ РАН (43,628604 ° N, 44,135084 ° W; с. Опытное, Терский р-н, Кабардино-Балкарская Республика) в 2023 году. Площадь участка — 2,0 га, предшественник — соя, площадь одной делянки — 3,9 м².

Почва опытного участка — чернозем обыкновенный, род почвы — карбонатный. Агрохимическая характеристика почвы опытного участка (по Чирикову): Р 2 О 5 подвижн.    9,8 мг/100 г почвы, К 2 О обмен. — 7,2 мг/100 г почвы, гумус (по Тюрину) — 4,4 %; рН 7,2. В пахотном горизонте содержалось 3,9-4,2 % гумуса, 18-27 мг азота, 27-34 мг подвижного фосфора и 230250 мг обменного калия.

Содержание каротиноидов в листовой ткани определяли с использованием реактива Фолча (35) на спектрофотометре УФ-1100 («Эковью», Россия). Листья пятого яруса второго растения в ряду собирали на стадии 5-6 сут после опыления около полудня, чтобы минимизировать возможное влияние интенсивности света. Отбирали три растения из трех рядов делянки одной линии (три биологических повторности). Листовые диски вырезали из средней части листа, избегая центральных жилок, гомогенизировали в жидком азоте и замораживали при — 80 ° C для последующего анализа методом Фолча (35). Все измерения проводили в трех аналитических повторностях.

Содержание каротиноидов рассчитывали по формулам:

Chlorophyll a ( —Д = 11.47(4 666 \ mL /

—

^ 75о )  2(^ 648

--

⁴750 ),

Chlorophyll b (^—Д\ = 21.85(4 648 \ —L /

-

4 750 ) - 4.53(4 666

-

^ 75o )>

Total carotenoids ( —^ = [10 0 0(4_48О \ —L /

-

4₇₅₀) - 1.33Chl a - 23.93 Chl b]/202 .

Экспрессию генов определяли в тех же тканях, гомогенизированных в жидком азоте, которые использовали для измерения содержания каротиноидов. Суммарную РНК выделяли из 50 мг листовой ткани (RNeasy Plant Mini Kit, «QIAGEN GmbH», Германия) и очищали от ДНК-контаминации

(RNase-free DNase set, «QIAGEN GmbH», Германия). Качество мРНК проверяли электрофорезом в 1,5 % агарозном геле, а количество определяли флуориметрически (Qubit® Fluorometer, «Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Полученную мРНК использовали для синтеза кДНК с праймером oligo-dT (GoScript Reverse Transcription System, «Promega Corporation», США).

Экспрессию генов определяли методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе CFX96 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad Laboratories», США) в двух биологических и трех аналитических повторностях. Реакцию проводили с использованием 3,0 нг кДНК и смеси для ПЦР-РВ с SYBR Green (НПК «Синтол», Россия). Условия реакции были следующими: 5 мин при 95 ° C (начальная денатурация); 15 с при 95 ° C (денатурация), 40 с при 60 ° C (отжиг/синтез цепи) (40 циклов).

Использовали следующие праймеры: PSY1-F (5'-CATCTTCAAA-GGGGTCGTCA-3') и PSY1-R (5'-CAGGATCTGCCTGTACAACA-3'), PSY2-F (5'-TCACCCATCTCGACTCTGCTA-3') и PSY2-R (5'-GATGTGA-TCTACGGATGGTTCAT-3'), LcyE-F (5'-TTTACGTGCAAATGCAGTCAA-3') и LcyE-R (5'-TGACTCTGAAGCTAGAGAAAG-3') (36). В качестве референсного гена для нормализации данных использовали ZmUbi (NM_001329666.1) с праймерами ZmUBI-rtF (5'-ATCGTGGTTGTGGCTTCGTTG-3') и ZmUBI-rtR (5'-GCTGCAGAAGAGTTTTGGGTACA-3').

Статистическую обработку результатов биохимических исследований проводили в программной среде Microsoft Excel 2013. Для сравнения средних значений между двумя группами использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Количественное определение общих каротиноидов осуществляли по методу двухфазной экстракции Фолча с последующим расчетом средних значений (M) и стандартных отклонений (±SD) (35). Статистическую обработку данных по экспрессии генов выполняли в программе Graph Pad Prism v. 9 , США).

Результаты. Проведенные измерения выявили значительную разницу у линий кукурузы из коллекции ИСХ КБНЦ РАН в содержании общих каротиноидов — от 25,98 до 120,87 мкг/г (рис. 1). Такой же значительный разброс был показан ранее для этих же образцов при определении содержания хлорофиллов a и b (37).

По содержанию каротиноидов анализируемые линии кукурузы можно было разделить на три группы: с высоким (> 90 мкг/г; 17 линий), средним (40-90 мкг/г; 103 линии) и низким (< 40 мкг/г; 30 линий) содержанием каротиноидов. Максимальное содержание каротиноидов мы выявили у линии 8007 (120,87 мкг/г), минимальное — у линии 849 (25,98 мкг/г). Разница между максимальным и минимальным значениями содержания общих каротиноидов в анализируемых линиях кукурузы составляла ~ 4,7 раза, что согласуется с результатами аналогичных исследований на кукурузе (38). Интересно, что некоторые линии (726, 728, 760, 944, 8007), выделенные ранее как высокохлорофильные (37), также характеризовались высоким содержанием каротиноидов. Это подтверждает показанную ранее положительную корреляцию между содержанием хлорофиллов и каротиноидов (39, 40).

Если рассматривать наиболее представительную группу со средним содержанием каротиноидов (103 линии), то разница между минимальным и максимальным значениями показателя в листьях также была довольно высока (в среднем более чем в 2,1 раза). Однако с практической точки зрения для селекции представляют интерес именно линии с существенно повышенным содержанием каротиноидов (например, 8007, 931, 944, 726).

Линия

Рис. 1. Содержание общих каротиноидов в листьях у 150 селекционных линий кукурузы ( Zea mays L.) из коллекции Института сельского хозяйства — филиала ФГБНУ ФНЦ Кабардино-Балкарский научный центр РАН. Звездочкой (*) отмечены линии, отобранные для анализа генной экспрессии ( n = 3, N = 3, M ±SD; опытное поле ИСХ КБНЦ РАН, с. Опытное, Терский р-н, Кабардино-Балкарская Республика, 2023 год).

Для анализа экспрессии ключевых генов каротиногенеза — фитоин-синтаз PSY1, PSY2 и ликопинциклаз LcyB и LcyE — методом ПЦР в реальном

времени были выбраны линии 944, 726, 804 и 849, контрастные по содержанию каротиноидов в листьях. Линии 944 и 726 были выбраны из-за их высокого содержания общих каротиноидов (соответственно 105,44 и 111,35 мкг/г), тогда как линии 804 и 849 характеризовались низким содержанием каротиноидов (соответственно 31,96 и 25,98 мкг/г).

Экспрессия гена PSY1 у линий 944 и 726 была примерно в 2 раза выше, чем у линии 849 (р < 0,01), и почти в 20 раз выше, чем у линии 804 (рис. 2). У линий 944 и 726 наблюдалась существенно более высокая экспрессия PSY2 , в то время как у линий 804 и 849 экспрессия этого гена была в 2 раза меньше.

Линия

Рис. 2. Результаты ПЦР-РВ анализа экспрессии генов PSY1 (A) , PSY2 (Б) , LcyB (В) и LcyE (Г) в листьях селекционных линий кукурузы ( Zea mays L.) из коллекции Института сельского хозяйства — филиала ФГБНУ ФНЦ Кабардино-Балкарский научный центр РАН, контрастных по содержанию каротиноидов: линии 944, 726 — с высоким содержанием, линии 804,849 — с низким содержанием. Референсный ген — ZmUbi ( n = 2, N = 3, M ±SD; опытное поле ИСХ КБНЦ PAH, с. Опытное, Терский р-н, Кабардино-Балкарская Республика, 2023 год).

Но при этом, если сравнивать количество мРНК генов PSY1 и PSY2 у одного образца , то у образцов 944, 726 и 849 экспрессия PSY1 в 2 раза превышала таковую для PSY2 . В то же время у образца 804 экспрессия PSY2 была в 5 раз выше, чем у PSY1 . Эти данные дополняют ранее полученные результаты по транскрипции генов фитоинсинтаз в проростках, согласно которым у одних линий кукурузы экспрессия гена PSY1 была выше, чем PSY2 , а у других линий экспрессии обоих генов оказалась сходной (10, 41).

Синтез каротиноидов в присутствии следовых количеств мРНК PSY2 у линии 804 мог быть обусловлен функциональной избыточностью PSY1 , за счет чего PSY1 компенсировал недостаток активности PSY2 . Также, согласно предыдущим исследованиям (37), линия 804 характеризовалась низким содержанием хлорофиллов, что потенциально снижало необходимость в высокой экспрессии генов фитоинсинтаз, одна из функций которых заключается в передаче поглощенной энергии хлорофиллу для фотохимических реакций.

Экспрессия гена LcyB у высококаротиноидных линий 944 и 726 была соответственно в 8,4 и 8,5 раза выше (р < 0,001), чем у линии 804, а в образце 849 экспрессия не детектировалась. Для гена LcyE наблюдалась сходная картина: экспрессия у линий 944 и 726 была высокой, тогда как у линий 804 и 849 отсутствовала или была следовой. Более высокая экспрессия 1148

LcyB могла быть связана с различием биологических функций и с потребностью растения в синтезе в -каротина и производных ксантофиллов для оптимизации процессов фотосинтеза и защиты от стрессовых факторов, тогда как LcyE кодирует s -ликопинциклазу, катализирующую образование 5 -каротина — первого предшественника в синтезе а -каротина, который менее распространен в листьях и функционально специфичен для эндосперма зерна (18). Исследования, проведенные на проростках, показали, что экспрессия гена LcyE превалирует на стадии прорастания (41).

Известно, что на транскрипцию генов биосинтеза каротиноидов значительное влияние оказывают такие внешние факторы, как освещенность, абиотический и биотический стресс (7, 10, 41), однако все растения в нашем опыте были выращены в одинаковых условиях, поэтому различия и в содержании общих каротиноидов, и в экспрессии анализируемых генов, тем более столь значительные, нельзя объяснить внешним воздействием. Исходя из этого, разница в полученных результатах экспрессионного анализа, по всей вероятности, может быть объяснена генетическими особенностями образцов и изменениями либо в промоторной области гена у конкретных линий в сайтах связывания с различными регуляторными факторами транскрипции, либо в самих белках транскрипционных факторов, регулирующих транскрипцию анализируемых генов.

Наши результаты указывают на тесную связь между повышенным содержанием каротиноидов у линий 944 и 726 и повышенной экспрессией ключевых генов их биосинтеза, что согласуются с ранее полученными данными, показывающими, что повышение экспрессии генов каротиноидного биосинтеза приводит к увеличенному накоплению каротиноидов в растительных тканях (21). Например, сверхэкспрессия генов PSY в эндосперме кукурузы значительно увеличивает общее содержание каротиноидов (42). Кроме того, дифференциальная экспрессия генов LcyB и LcyE может влиять на состав каротиноидов, изменяя не только их общее содержание, но и про-порцию/долю отдельных пигментов с провитаминной активностью (43).

Итак, мы установили широкий разброс в содержании общих каротиноидов в листьях у 150 линий кукурузы из коллекции ИСХ КБНЦ РАН — от 25,98 до 120,87 мкг/г, что позволило разделить их на три группы и выявить 17 линий с высоким содержанием общих каротиноидов (> 90 мкг/г), таких как линии 8007, 944, 726 и 931. Молекулярно-генетический анализ выявил, что повышенное накопление каротиноидов у линий сопряжено с усиленной транскрипцией ключевых генов биосинтетического пути — генов фитоенсинтаз PSY1 и PSY2 , а также ликопинциклаз LcyB и LcyE . Отобранные линии будут введены в селекционный процесс для создания сортов/ги-бридов кукурузы кормовой направленности с высоким содержанием микронутриентов. Следует отметить, что, помимо улучшения кормовой ценности линий кукурузы с повышенным содержанием каротиноидов, такие растения будут более эффективно наращивать вегетативную массу (из-за прямой связи содержания хлорофиллов и каротиноидов), а также будут более устойчивы к абиотическим стрессам благодаря антиоксидативной функции каротиноидов и их связи с содержанием абсцизовой кислоты.