Оценка предсказательной значимости рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста VEGFR-2 у больных тройным негативным раком молочной железы

Введение. Поиск информативных молекулярно-генетических маркеров тройного негативного рака молочной железы, обладающих высокой предсказательной значимостью в отношении ответа опухоли на проводимую терапию, является актуальной научной задачей. Целью исследования явилось изучение взаимосвязи экспрессии рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста VEGFR-2 и полиморфных вариантов гена KDR с эффективностью неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) у больных тройным негативным раком молочной железы. Методы. В исследование включено 70 больных операбельным тройным негативным раком молочной железы (T_1–3N_0–3M₀), получавших 2–4 курса НАХТ по схемам FAC и CAX. Оценка эффективности НАХТ осуществлялась по шкале RECIST. Уровень экспрессии VEGFR-2 оценивался иммуногистохимическим методом. Изучение полиморфных вариантов гена KDR (rs2071559, rs2305948) проведено с помощью ПЦР в режиме реального времени. Результаты. Показано, что достижение полных морфологических регрессий на фоне проведения НАХТ ассоциировано с возрастом до 50 лет (р=0,0044) и высоким уровнем экспрессии Ki67 (≥20) (р=0,0322). Отмечено, что у пациентов, получавших лечение по схеме CAX, эффективность НАХТ была значимо выше по сравнению с группой больных, получавших FAC режим (р=0,0246). Кроме того, все случаи полной морфологической регрессии были ассоциированы с отсутствием экспрессии VEGFR-2 в опухолевой ткани после оперативного лечения (р=0,0000). Наличие экспрессии VEGFR-2 (негативной или позитивной) в опухолевой ткани до лечения сопряжено с полиморфизмом гена KDR rs2071559 (r=-0,297; p=0,0273). Выявлена значимая корреляционная связь между KDR rs2071559 и уровнем экспрессии VEGFR-2 (менее 70, 70 % и более) в опухолевой ткани до лечения (r=-0,314; p=0,0297). Результаты многофакторного логистического регрессионного анализа свидетельствуют, что молодой возраст пациенток (≤50 лет), отсутствие экспрессии VEGFR-2 после операции и схема CAX являются статистически значимыми предикторами эффективности НАХТ. Заключение. Уровень экспрессии VEGFR-2 в опухолевой ткани и полиморфные варианты гена KDR могут рассматриваться в качестве новых дополнительных предсказательных молекулярных критериев у больных тройным негативным раком молочной железы при проведении НАХТ.

Тройной негативный рак молочной железы (РМЖ) составляет около 8–20 % всех опухолей молочной железы, характеризуется отсутствием экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона и HER2/neu, наиболее агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом среди всех подтипов рака молочной железы [1, 2]. Накопленные к настоящему моменту знания свидетельствуют о гетерогенности тройного негативного рака молочной железы, имеющего различные морфологические и молекулярные особенности, а также ответ на системную химиотерапию [3]. Поиск информативных молекулярно-генетических характеристик данного подтипа рака молочной железы по-прежнему актуален, поскольку позволит сформировать оптимальные подходы не только к

прогнозированию течения этого заболевания, но и определению резистентности / чувствительности опухоли к проводимой терапии.

Рецепторы факторов роста и их лиганды являются в настоящее время перспективными молекулярными маркерами, исследование экспрессии которых дает возможность оценить активность процессов пролиферации, апоптоза и ангиогенеза в опухоли. Система сосудистых эндотелиальных факторов роста (VEGF) является основным регулятором образования новых сосудов в опухоли [4]. Данное семейство представлено несколькими секреторными гликопротеинами, в частности VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и VEGF-E. Все представители семейства VEGF могут связываться со специфическими VEGF-тирозинкиназными рецепторами 1, 2 и 3-го типа (VEGFRs 1, 2, 3). Рецептор 2-го типа VEGFR-2 (или KDR – kinase insert domain receptor) является основным медиатором биологического действия VEGF-A. Cвязывание VEGF-А с экстраклеточным фрагментом VEGFR-2 рецептора приводит к его гомо- или гетеродимеризации, активации внутриклеточных сигнальных путей (PI3K/Akt, MAPK, eNOS, FAK), пролиферации и миграции эндотелио-цитов, экспрессии антиапоптотических белков, а также увеличению проницаемости микрососудов [5]. В настоящее время доказано, что уровень экспрессии VEGF-А и его рецептора VEGFR-2 связан с биологической агрессивностью рака молочной железы. Выявлена прямая корреляция между высоким уровнем VEGF-А (как в ткани молочной железы, так и в сыворотке крови) и негативным рецепторным статусом опухоли, лимфогенным метастазированием и низкими показателями общей выживаемости больных раком молочной железы [6, 7, 8]. Показано, что уровень VEGF-А в сыворотке крови может рассматриваться как прогностический фактор, ассоциированный с ответом на метроном-ную низкодозовую химиотерапию капецитабином в комбинации с циклофосфамидом у больных метастатическим раком молочной железы [9]. В недавнем исследовании Jansson et al. [10] установлено, что у пациентов с тройным отрицательным рецепторным фенотипом отмечается высокий уровень экспрессии с KIT, VEGFR-2 и PDGFRa в опухолевой ткани по сравнению с пациентами, имеющими другой молекулярный подтип. Выявлено, что высокий уровень экспрессии маркеров эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ) Twist1 и Vimentin сопряжен с высоким уровнем экспрессии VEGFR-2 в опухоли молочной железы, что свидетельствует о его возможной роли в процессах ЕМТ [11].

Функциональные полиморфные сайты гена рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста являются одним из факторов, определяющих индивидуальные особенности течения заболевания. Однонуклеотидная замена (SNP) -604T>C в промоторном регионе гена KDR (rs2071559) ведет к структурной перестройке сайта связывания с фактором транскрипции E2F, вовлеченным в процессы регуляции клеточного цикла, что в конечном итоге приводит к снижению экспрессии белка VEGFR-2. Полиморфный локус 1192G/А в 7 экзоне (rs2305948), расположенный в экстрацеллюлярной области гена KDR, также является функционально значимым, поскольку затрагивает лиганд-связывающий регион. Несинонимичная замена валина на изолейцин в 297 позиции приводит к снижению эффективности связывания VEGF-А с VEGFR-2, что определяет низкую активность каскада внутриклеточных реакций, обеспечивающих миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток. Вместе с тем перечисленные маркеры остаются недостаточно изученными в плане их предсказательной значимости. Кроме того, оценка влияния различных схем неоадъювантной химиотерапии на экспрессию ангиогенных факторов может стать основой для назначения более адекватной тактики лечения тройного негативного рака молочной железы.

Целью исследования явилось изучение взаимосвязи экспрессии рецепторов VEGFR-2 и полиморфных вариантов гена KDR с эффективностью неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) у больных тройным негативным раком молочной железы.

Материал и методы

В исследование включено 70 больных операбельным тройным негативным раком молочной железы (T_1-3N₀ _3 M₀), получавших лечение на базе отделения общей онкологии Томского НИИ онкологии с 2007 по 2013 г. Возраст пациенток, вошедших в исследование, варьировал от 28 до 69 лет (средний возраст 48 ± 10 лет). У 39 (55,7 %) больных отмечалась сохранная менструальная функция, у 31 (45,3 %) – состояние менопаузы. Размер первичного опухолевого узла менее 50 мм отмечался у 64 (91,4 %) больных, у 6 (8,6 %) пациенток новообразования были 50 мм и более. У 49 (70 %) пациенток отсутствовало метастатическое поражение аксиллярных лимфатических узлов (N₀), у 21 (30 %) наблюдалось поражение от 1 до 10 лимфатических узлов (N_1-3). Распределение по стадиям РМЖ: I (T 1 N 0 M 0 ) стадия - 5 (7,1 %), IIA (T 1 ₂N₀ 1 M₀) и IIB (T_{2 3}N₀ 1 M 0 ) стадия - 58 (82,9 %), III стадия (T_1-4N_0-3M₀) - 7 (10 %) больных. Инвазивная карцинома неспецифического типа выявлена у 53 (75,7 %) больных, в 5 (7,1 %) случаях диагностированы редкие формы РМЖ, представленные медуллярным раком. Пациенток с базальноподобным подтипом 56 (80 %), с небазальноподобным – 8 (11,4 %).

На предоперационном этапе все пациентки получили 2–4 курса полихимиотерапии: 27 (38 %) больным проводилась терапия по схеме FAC (5-фторурацил 500 мг/м2 в 1-й день, адриамицин

50 мг/м2 в 1-й день, циклофосфамид 500 мг/м2 в 1-й день, внутривенно; интервал между курсами - 21 день), 43 (62 %) - по схеме CAX (циклофос-фан 100 мг/м2 внутримышечно в течение 14 дней, адриамицин 30 мг/м2 внутривенно в 1-й и 8-й дни, кселода 1000 мг/м2 2 раза в день, per os, в течение 14 дней; интервал между курсами – 21 день). Оперативный этап осуществлялся через 2–3 нед после завершения курсов НАХТ Интраоперационная лучевая терапия в дозе 10 Гр проведена 42 (60 %) пациенткам во время выполнения органосохраняющего хирургического вмешательства. В адъювантном режиме все больные получили 2–4 курса химиотерапии по схеме FAC. Лучевая терапия проводилась по показаниям.

Оценка эффективности неоадъювантной химиотерапии осуществлялась по шкале RECIST (2000) по результатам клинического осмотра, УЗИ молочных желез и маммографии. При частичной регрессии (30 % и более) после 2 курсов НАХТ лечение продолжалось до 4 курсов, при эффективности менее 30 % - осуществляли хирургический этап лечения. Частота полных и частичных морфологических регрессий была одинакова и составила 38,6 %, стабилизация процесса наблюдалась в 17,1 %, прогрессирование – в 5,7 % случаев (табл. 1).

У всех пациенток, включенных в исследование, диагноз был верифицирован морфологически. Забор материала для морфологического исследования осуществлялся до начала лечения (биопсийный) и после выполнения оперативного лечения (операционный). Материал фиксировался в 10–12 % нейтральном формалине. Проводка осуществлялась по стандартной методике. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучалась ткань первичной опухоли, все удаленные лимфатические узлы. Диагноз рака молочной железы устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2012). Выраженность лекарственного патоморфоза в ткани молочной железы и регионарных лимфатических узлах оценивалась по схеме, предложенной Е.Ф. Лушниковым (1977 г.). Диагноз «полная морфологическая регрессия» устанавливался при отсутствии опухолевых элементов как в ткани молочной железы, так и в исследуемых лимфатических узлах. Сроки наблюдения за больными составили от 12 до 60 мес.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) биопсийного и операционного материала проводилось по стандартной методике. Использовались антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), прогестерона (клон PgR 636, RTU, мышиные), к онкопротеину c-erbB-2 (HER2/neu статус) (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные «Novocastra»), к CK 5/6 (клон D5/16 B4, рабочее разведение 1:100, мышиные, «Diagnostic BioSystems»), к EGFR1 (клон SP9, рабочее раз-

Таблица 1 Распределение больных тройным негативным раком молочной железы в зависимости от основных клинико-морфологических параметров

Параметры Количество больных (n=70) Состояние менструальной функции сохранена 39 (55,7 %) менопауза 31 (44,3 %) Размер первичного опухолевого узла менее 50 мм 64 (91,4 %) 50 мм и более 6 (8,6 %) Состояние лимфатических узлов N0 49 (70,0 %) N1-3 21 (30,0 %) Стадия опухолевого процесса I 5 (7,1 %) II 58 (82,9 %) III 7 (10,0 %) Гистологический тип инвазивная карцинома 53 (75,7 %) медуллярный рак 5 (7,1 %) не определено 12 (17,2 %) Подтип трижды негативного рака молочной железы базальноподобный 56 (80,0 %) небазальноподобный 8 (11,4 %) не определено 6 (8,6 %) RECIST полная регрессия 27 (38,6 %) частичная регрессия 27 (38,6 %) стабилизация 12 (17,1 %) прогрессирование 4 (5,7 %) Схема НАХТ FAC 27 (38,6 %) CAX 43 (61,4 %) ведение 1:600, кроличьи, «Novus Biologicals»), к VEGFR-2 (клон P-GF.44C, рабочее разведение 1:600, кроличьи, «Zymed Laboratories»). Оценка экспрессии рецепторов к половым гормонам осуществлялась количественным методом [12]. Уровень экспрессии Ki67<20 % оценивался как низкий, >20 % - как высокий. Для рецепторов к эндотелиальному фактору роста VEGFR-2 определялись наличие экспрессии, локализация (цитоплазма, мембрана и цитоплазма), выраженность (выраженная, умеренная, слабая) и уровень экспрессии (низкий – менее 70 %, высокий – 70 % и более).

С целью оценки полиморфных вариантов гена KDR проводилось выделение ДНК из образцов периферической крови с помощью наборов «QIAamp dNaMini Kit» (50) (Qiagen). Качественная и количественная оценка ДНК проведена на спектрофотометре NanoDrop-1000 («NanoDrop», США). Изучение полиморфных вариантов KDR -604T>C rs2071559 и KDR 1192G>A rs2305948 выполнено с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Последовательность праймеров и проб подбирали при помощи программы OligoAnalysisVector NTI с использованием генетического банка данных (. Реакционная смесь для ПЦР объемом 15 мкл включала 100 нг геномной ДНК; 0,5–1,5 мкл специфической пары праймеров и проб с концентрацией 1 о.е./мл; 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата; 1,2–2,0 мкл буфера (60 мМTris-HCl (pH 8,5 при 25 °C), 1,5 мМ MgCl2; 25 мМKCl; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1 % Тритон X-100) и 0,5–1,0 ед. Taq ДНК-полимеразы («Ме-диген», Новосибирск). Программа амплификации предполагала предварительную денатурацию при 95°С в течение 2 мин, с последующими 40 циклами денатурации при 95°С (10 сек), отжига при специфической температуре для каждой пары праймеров (30 сек) на амплификаторе ICycler IQ5 («Bio-Rad», США).

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288), на основании разрешения локального комитета по биомедицинской этике Томского НИИ онкологии. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 7.0. Применялись критерий χ2, корреляционный анализ и логистический регрессионный анализ. Обсуждались результаты с достоверностью различий при р<0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования проведен анализ взаимосвязи основных клинико-морфологических параметров, уровня экспрессии рецепторов VEGFR-2, полиморфных вариантов гена KDR с эффективностью неоадъювантной химиотерапии у больных тройным негативным раком молочной железы. Поскольку достижение полных морфологических регрессий является наиболее важным критерием эффективности НАХТ, были сформированы две исследуемые группы: группа больных с полной морфологической регрессией опухоли (27 пациенток) и группа пациенток, у которых на фоне проведения НАХТ отмечались частичная регрессия опухоли или стабилизация процесса (39 пациенток).

Показано, что полные морфологические регрессии чаще наблюдались у больных в возрасте до 50 лет по сравнению с пациентками старшей возрастной группы (р=0,0044). В группе женщин с сохранной менструальной функцией была выявлена тенденция к повышению количества полных морфологических регрессий (р=0,0513; табл. 2).

Выявлено, что достоверно чаще достижение полных морфологических регрессий отмечалось у больных с экспрессией Ki67≥20 % (р=0,0322). Важно отметить, что все случаи полной морфологиче- ской регрессии были ассоциированы с отсутствием экспрессии VEGFR-2 в опухолевой ткани после оперативного лечения (р=0,0000). Кроме того, достижение полных морфологических регрессий сопряжено с носительством дикого аллеля G гена KDR rs2305948, однако различия не достигают статистической значимости (р=0,0814). Отмечено, что у пациенток, получавших предоперационное лечение с включением капецитабина, эффективность НАХТ была значимо выше по сравнению с группой больных, получавших стандартную антрациклинсодержащую схему (р=0,0246).

Анализ корреляционных взаимосвязей показал, что наличие экспрессии VEGFR-2 (негативной или позитивной) в опухолевой ткани до лечения значимо ассоциировано с полиморфизмом гена KDR rs2071559 (r=-0,297; p=0,0273). Кроме того, выявлена значимая обратная корреляционная зависимость между KDR rs2071559 и уровнем экспрессии VEGFR-2 (менее 70 %, 70 % и более) в опухолевой ткани до лечения (r=-0,314; p=0,0297).

На втором этапе исследования для прогнозирования эффективности неоадъювантной химиотерапии у больных тройным негативным раком молочной железы был использован многофакторный логистический регрессионный анализ. В качестве независимых признаков выступали такие параметры, как возраст пациенток на момент диагноза, состояние менструальной функции, уровень маркера клеточной пролиферации Ki67, экспрессия VEGFR-2 после операции, полиморфизм KDR rs2305948 и схема неоадъювантной химиотерапии. Однако из всех включенных признаков только молодой возраст пациенток (≤50 лет), отсутствие экспрессии VEGFR-2 после операции и схема CAX явились статистически значимыми предикторами эффективности НАХТ (табл. 3).

Данные о прогностической значимости VEGFR-2 при раке молочной железы, представленные в основном в зарубежных публикациях, немногочисленны и противоречивы. Высокий уровень экспрессии VEGFR-2 в опухолевой ткани считается предиктором неблагоприятного прогноза у больных тройным негативным раком молочной железы, получавших адъювантную химиотерапию [13]. Однако обратная корреляция выявлена у больных базальноподобным раком молочной железы [14]. В исследованиях Kallegri et al. [15] и Pizon et al. [16] показано, что уровень экспрессии VEGFR-2 на циркулирующих эпителиальных опухолевых клетках не коррелирует с рецепторным статусом, стадией заболевания и лимфогенным / гематогенным метастазированием у больных раком молочной железы. Вместе с тем предсказательная оценка экспрессии VEGFR-2 в современных источниках не освещена. Результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что отсутствие экспрессии VEGFR-2 в опухолевой ткани после НАХТ может быть связано с высокой вероятностью достижения

Таблица 2

Эффективность НАхТ у больных тройным негативным раком молочной железы в зависимости от основных клинико-морфологических и молекулярно-генетических параметров

Параметры	Кол-во больных	Эффективность НАХТ		p
		Полная регрессия	Частичная регрессия и стабилизация
Возраст ≤50	35	20 (57,1 %)	15 (42,9 %)
≥50	31	7 (22,6 %)	24 (77,4 %)	0,0044
Состояние менструальной функции сохранена	37	19 (51,4 %)	18 (48,6 %)
менопауза	29	8 (27,6 %)	21 (72,4 %)	0,0513
Размер первичного опухолевого узла менее 50 мм	60	26 (43,3 %)	34 (56,7 %)
50 мм и более	6	1 (16,7 %)	5 (83,3 %)	0,3880
Состояние лимфатических узлов N0	49	23 (46,9 %)	26 (53,1 %)
N1-3	17	4 (23,5 %)	13 (76,5 %)	0,0907
Подтип трижды негативного рака молочной железы базальноподобный	7	3 (42,9 %)	4 (57,1 %)
небазальноподобный	53	19 (35,8 %)	34 (64,2 %)	0,6997
Уровень маркера клеточной пролиферации Ki-67 ≤ 20 %	19	4 (21,1 %)	15 (78,9 %)
Ki-67 ≥ 20 %	44	22 (50,0 %)	22 (50,0 %)	0,0322
Экспрессия VEGFR-2 до операции негативная	12	5 (41,7 %)	7 (58,3 %)
позитивная	48	17 (35,4 %)	31 (64,6 %)	0,7444
Экспрессия VEGFR-2 после операции негативная	27	23 (85,2 %)	4 (14,8 %)
позитивная	20	0 (00,0 %)	20 (100,0 %)	0,0000
KDR rs2071559 T аллель	64	26 (40,6 %)	38 (59,4 %)
C аллель	52	18 (34,6 %)	34 (65,4 %)	0,5070
KDR rs2305948 G аллель	110	44 (40,0 %)	66 (60,0 %)
A аллель	6	0 (00,0 %)	6 (100,0 %)	0,0814
Схема НАХТ FAC	24	5 (20,8 %)	19 (79,2 %)
CAX	42	22 (52,4 %)	20 (47,6 %)	0,0246

Таблица 3

Многофакторный логистический регрессионный анализ для прогнозирования эффективности НАхТ у больных тройным негативным раком молочной железы

Сравниваемые параметры	Estimate	Standard error	Wald	P-value
Возраст: ≤ 50 vs ≥ 50	0,189	0,072	6,762	0,0126
Схема НАХТ: FAC vs CAX	-0,183	0,074	7,855	0,0166
Экспрессия VEGFR-2 после операции: негативная vs позитивная	-0,762	0,074	34,286	0,0000

полных морфологических регрессий у больных трижды негативным раком молочной железы. Кроме того, независимыми прогностическими факторами эффективности НАХТ в нашем исследовании являются молодой возраст пациенток и схема CAX. Предшествующими исследованиями нами была показана высокая предикторная значимость капецитабинсодержащей схемы в отношении объ- ективного клинического ответа у больных тройным негативным раком молочной железы [17, 18]. Настоящее исследование демонстрирует высокую эффективность использования предоперационного режима с капецитабином в отношении полных морфологических регрессий, что подтверждается данными других авторов [19, 20]. Однако результаты анализа III фазы GeparQuattro клинического исследования показали, что добавление в схему лечения капецитабина (5 курсов по схеме EC-T: эпирубицин, циклофосфамид, доцетаксел плюс ка-пецитабин) не приводит к увеличению количества полных морфологических регрессий [21]. Недавний метаанализ пяти клинических исследований, включающий 3 257 пациенток, свидетельствует об отсутствии повышения эффективности неоадъювантной химиотерапии, включающей капецитабин, антрациклины и таксаны, по сравнению с режимами без капецитабина [22]. Следует отметить, что неоднозначность имеющихся данных может быть связана с отсутствием в ряде исследований стратификации пациентов по молекулярному подтипу опухоли и использованием различных режимов с включением капецитабина.

Результаты изучения генетических полиморфизмов VEGFR-2 при раке молочной железы, представленные в зарубежных источниках, крайне немногочисленны. В исследовании случай-контроль Shanghai Breast Cancer Genetics Study (SBCGS) показано, что SNP rs2305948 не связан с риском развития рака молочной железы [23]. Не выявлено значимых ассоциаций данного полиморфизма с прогнозом [24, 25] и показателями общей/безрецидивной выживаемости у больных раком молочной железы [26]. Проведенный в настоящей работе анализ полиморфизма гена KDR (rs2305948) показал, что шанс достичь полной морфологической регрессии есть только у но- сителей дикого аллеля G, ассоциированного с замедлением процессов ангиогенеза в опухоли. Другой SNP rs2071559 показал взаимосвязь с уровнем экспрессии VEGFR-2 в опухолевой ткани до лечения. Таким образом, полиморфные варианты гена KDR, влияя на уровень экспрессии белка VEGFR-2 или изменяя степень сродства VEGF-А к рецептору VEGFR-2, могут определять активность VEGF/KDR сигнального каскада и, соответственно, могут быть связаны как с менее, так и с более агрессивным клиническим течением рака молочной железы.