Оценка продолжительности культивирования регенерирующих каллусных тканей проса in vitro

1. Масса, объем каллусной ткани и число растений-регенерантов проса в зависимости от времени культивирования на среде MС
Продолжительность культивирования in vitro, сут	Масса каллусной ткани, г	Объем каллусной ткани, см3	Число растений-регенерантов
5	0,07	0,13	0,18

10	0,16	0,45	0,30
15	0,28	0,54	0,42
20	0,56	1,33	0,49
25	0,93	2,43	1,00
30	0,91	2,71	0,58
35	1,93	5,10	2,17
40	1,73	2,71	1,48
50	l,69	4,45	1,51
НСР 05	0,32	0,72	0,39
П р и м е ч а н и е: r масса-объем =	0,96; r масса-число раст. = 0,93; r объем-число раст.	= 0,94.

На 35-е сут культивирования средняя масса и объем каллусных тканей составляли соответственно 1,93 г и 5,10 см3. На каждый стаканчик в среднем приходилось по 2,17 шт. растений-регенерантов длиной более 1,5 см, пригодных для перевода в нестерильные условия. Различия между регенерирующими каллусными клонами проявлялись по числу растений и объему каллусной ткани (табл. 2). По массе каллус-ных тканей клоны не различались.

2. Масса, объем каллусной ткани и число растений-регенерантов проса в зависимости от клона

Клон	Масса каллусной ткани, г	Объем каллусной тка- 3 ни, см	Число растений-регенерантов
gml	0,92	2,3	0,69
am129	0,88	2,8	0,74
am26	0,91	1,5	1,28
НСР 05	0,19	0,42	0,23

На основе оценки динамики развития регенерирующих каллусных тканей растений проса трех клонов (gm1, am129, am26) нами была разработана оптимальная схема культивирования и пересадки в нестерильные условия с целью получения наибольшего числа корнесобственных растений-регенерантов с наименьшими затратами времени и расходных материалов (табл. 3).

3. Схема пересадки в нестерильные условия регенерирующих каллусных тканей растений проса

Продолжительность культивирования in vitro, сут	Число растений-регенерантов	Число периодов продолжительностью 5 сут	Среднее число растений-регенерантов
5	0,18	1	0,18
10	0,30	2	0,15
15	0,42	3	0,14
20	0,49	4	0,12
25	1,00	5	0,20
30	0,58	6	0,10
35	2,17	7	0,31
40	1,48	8	0,19
50	1,51	10	0,15

Исследование динамики изменения числа растений проводили с 5-суточным интервалом, причем в расчет принимали число периодов продолжительностью 5 сут, приходящихся на время культивирования каллусных тканей in vitro (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50-е сут). Подсчитывали число растений, полученных в течение 5 сут культивирования в каждом варианте: максимальное число растений отражало оптимальное время для пересадки (см. табл. 3). Наибольшее число регенерантов, полученных в пересчете на период продолжительностью 5 сут, приходилось на 35-е сут культивирования, то есть оптимальный срок культивирования перед пересадкой кал-лусных тканей составляет 35 сут. Если клонированию подлежат регенеранты из одного стаканчика и для пересадки берут два участка регенерирующей каллусной ткани, то можно определить число регенерантов (un) на n-м этапе клонирования. При этих условиях зависимость между показателями можно представить в виде геометрической прогрессии: un = 2,17⋅2n–1. Если принять в расчет все регенеранты, имеющиеся на начало клонирования, тогда обобщенная формула принимает вид un = aqn–1, где а — число регенерантов, пригодных к переводу в нестерильные условия в начале клонирования; q — число участков из одной регенерирующей каллусной ткани. По правилу суммирования членов геометрической прогрессии находим общее число регенерантов, получаемых на n-м этапе клонирования: Sn = u1 + u2 + u3 ...+ un + ..., или

S n =

a (1 - qn) i - q

Преобразуем эту формулу с целью определения необходимого количества этапов клонирования для получения запланированного числа регенерантов: Sn(l – q) = a(l – qn);

S n (1 ^- q )

a

= 1 - qn;

q n = 1 -

S n (1 - q )

a

a - Sn (1 - q)

a

In [a - Sn (1 - q)] - ln a n =

ln q

Этапы клонирования представляют все члены геометрической прогрессии, включая начальный клоновый материал. Следовательно, число пересадок (р) на еди- ницу меньше числа членов:

p = n – 1, или

P =

ln [a - Sn (1 - q)] - ln a

ln q

- 1.

Как правило, число пересадок, рассчитанное по формуле [3], не является целым, поэтому для получения заданного числа регенерантов выполняют все полные пересадки, а для последней берут только часть имеющегося в наличии материала. Исходное число регенерантов ( a 1 ) для проведения последней неполной пересадки определяют по следующей формуле:

S - S a =   ----nn,                              [4]

1q где Sn — запланированное число регенерантов на этапе клонирования n = = р + 1; Snn — сумма растений-регенерантов на последнем полном этапе клонирования n = р + 1, где р — целое число. Величину Snn рассчитывают по формуле [1]. Для последней пересадки берут такое количество единиц культуральной посуды, в котором было бы представлено число регенерантов, равное а1.

Итак, процесс получения регенерантов в культуре пыльников проса включает три этапа: формирование эмбриогенных каллусных тканей; стимулирование интенсивного регенерационного процесса; длительное культивирование непрерывно регенерирующих каллусных тканей на среде без регуляторов роста (3). При этом для клонов gml, am129 и am26 средняя продолжительность первых двух этапов составляет 75 сут, а период длительного культивирования непрерывно регенерирующих кал-лусных тканей — 825 сут. Продолжительность третьего этапа по отношению ко всему периоду культивирования занимает 91,7 % времени. Практически все растения-регенеранты отбирают на этапе длительного культивирования регенерирующих кал-лусных тканей. При этом перевод корнесобственных регенерантов в нестерильные условия совпадает с переносом участков регенерирующих каллусных тканей на свежие среды.

Предложенный способ оптимизации пересадок растений-регене-рантов в нестерильные условия основан на перерасчете числа регенерантов на определенный промежуток времени. Перерасчет можно вести и на одни сутки культивирования, что в принципе не меняет сути дела. Максимальное число регенерантных растений, приходящееся на единицу времени, отражает оптимальный срок пересадки. Разработанная формула для определения числа пересадок, исходя из запланированного числа растений-регенерантов, позволяет охватить весь период культивирования регенери- рующих каллусных тканей. Необходимым условием при использовании этой формулы является наличие данных по начальному количеству регенерантов и числу пересаживаемых участков, приходящихся на одну регенерирующую каллусную ткань.

Таким образом, нами показана возможность формализации динамических характеристик длительно культивируемых in vitro регенерирующих каллусных тканей, что позволяет на этой основе разрабатывать количественные модели клонирования растений проса.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.   H e y s e r J.W., N a b o r s M.W. Regeneration of proso millet from embryogenic calli derived from vari

  ous plant parts. Crop Science, 1982, 22, 5: 1070-1074.

• 2.   R a n g a n T.S., V a s i l I.K. Somatic embriogenesis and plant regeneration in tissue cultures of Panicum

  miliaceum L. and Panicum miliare Lamk. Z. Pflanzenphysiology, 1983, 109: 49-53.

• 3.    Б о б к о в С.В. Получение корнесобственных регенерантов в культуре пыльников проса. Вест. РАСХН, 2000, 5: 41-43.

• 4.    Б о б к о в С.В. Получение корнесобственных регенерантных растений проса в культуре незрелых соцветий и пыльников. С.-х. биол., 2002, 5: 65-68.

• 5.    M u r a s h i g e Т., S k o o g F. A revised medium for rapid growth and bioasseys with tobacco tissue cultures. Physiology Plant, 1962, 15, 13: 473-497.

• 6.    G a m b o r g О., E v e l e i g h D.E. Culture methods and detection of gluconases in cultures of wheat and barley. Can. J. Biochem., 1968, 46, 5: 417-421.

Всероссийский НИИ зернобобовых и                          Поступила в редакцию 22

крупяных культур , 302502, Орел, п/о Стрелецкое                          июля 2002 года

ESTIMATION OF DURATION OF CULTIVATION OF

REGENERATING CALLUS TISSUES OF MILLET IN VITRO

S u m m a r y

The author investigated the determinants of regenerating callus tissues of millet during long-term cultivation in vitro.The way of optimization of callus tissues transfer on fresh media with adaptation of scion-rooted plants-regenerants to nonsterile conditions was developed. The formalization of dynamic characteristics in longterm cultivated in vitro regenerating callus tissues was shown, that permit to develop on this basis the quantitative models for cloning of millet plants. The formula was proposed for determination of essential number of planting to nonsterile conditions in connection with established number of plants-regenerants.