Оценка роли актинобактерий в активности глубоководных эндемичных видов амфипод, принадлежащих к роду Ommatogammarus

Термин «симбиоз» с момента своего возникновения в 1879 году изменил свое значение, однако не утратил актуальности. Основоположник термина немецкий ботаник Антуан де Бари в своей работе «Die Erscheinung der Symbiose» описывал симбиоз, как сожительство видов в течение длительного времени, противопоставляя «симбиоз» понятиям «паразитизм» и «комменсализм» (Bonfante and Genre , 2010). Однако позже под симбиозом стали понимать любые виды сожительств. Таким образом, «симбиоз» стал более общим термином, включающим в себя разные по характеру взаимоотношения организмов друг с другом.

Одни из наиболее хорошо изученных симбиозов между беспозвоночными и микроорганизмами являются ассоциации губок и бактерий (Taylor et al ., 2007). Несмотря на то, что большинство исследований проведено на морских губках, некоторые из них также затрагивают тему пресноводных беспозвоночных и уникальных экосистем, как новых источников полезных штаммов актинобактерий и антибиотиков (Costa et al. , 2013; Duncan et al. , 2015; Axenov-Gribanov et al. , 2015).

Одной из экосистем, уникальной по своим характеристикам - древней и мало изученной в аспекте актинобактериального разнообразия, является озеро Байкал и его обитатели. Озеро Байкал, объект мирового наследия ЮНЕСКО, расположено в Восточной Сибири. Это одно из самых древних озер планеты (около 25-30 млн. лет) и крупнейшее озеро по объему пресной воды. Озеро населено более чем 2500 видами животных при уровне эндемизма — 80% (Timoshkin et al. , 2001). Вся водная толща озера насыщена кислородом и характеризуется узким диапазоном температурных флуктуаций.

Данные факторы создают особые условия для каждого организма, обитающего в озере. В таких постоянных условиях беспозвоночные эволюционировали в течение последних миллионов лет. Одной из таких групп являются амфиподы ( Amphipoda, Crustacea ).

Амфиподы – неотъемлемая часть экосистемы озера Байкал. Байкальские амфиподы составляют 45,3% от мировой пресноводной фауны амфипод и представлены 276 видами и 78 подвидами со 100% эндемичностью (Takhteev et al. , 2015). Они населяют все экологические ниши озера от зоны литорали до абиссали. Особый интерес при этом представляют глубоководные амфиподы, которые, являясь падальщиками, играют важную роль в системе самоочистки озера.

Целью настоящего исследования являлось выявление ассоциаций между культивируемыми штаммами актинобактерий и глубоководными эндемичными амфиподами озера Байкал.

MATERIALS AND METHODS

Для настоящего исследования два вида амфипод рода Ommatogammarus - O. albinus и O. flavus - были выловлены с различных глубин в южной части озера Байкал возле поселка Большие Коты (51.9053° N, 105.0753° E). Представители вида O. albinus были выловлены с глубин 80 и 200 м, а вида O. flavus - с глубин 80, 100 и 200 м. Каждый образец включал от 3 до 5 амфипод. С каждой глубины отобрано по 5 образцов. Амфиподы были пойманы с применением глубоководных ловушек. Поднятые образцы амфипод были отмыты в воде, спирте и зафиксированы (гомогенизированы в 20% растворе глицерина), в соответствии с Axenov-Gribanov et al . (2015).

Культивируемые штаммы актинобактерий выделены на твердых питательных средах. Шесть питательных сред (MS, ISP, крахмало-аммиачный агар, среда Гаузе №1, среда Ваксмана, среда Чапека), содержащих в своем составе антибиотики циклогексимид (50 мг/мл) и фосфомицин (100 мг/мл), были использованы для выделения чистых культур актинобактерий (Kieser et al. , 2000). Аликвоты образцов были предварительно прогреты в течение 5 минут при температуре 50 °С для активации прорастания спор и подавления роста вегетативных клеток других бактерий. Культуры актинобактерий отобраны по морфологическим признакам и получены посредством инкубации микробиологических посевов гомогенатов амфипод в течение 30 дней при температуре 28 °С.

Идентификацию штаммов проводили посредством амплификации и секвенирования гена 16S рРНК с праймерами: 8F (AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG), 1510R (TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T), ACT235F (CGC GGC CTA TCA GCT TGT TG) и ACT878R (CCG TAC TCC CCA GGC GGG G). Полученные нуклеотидные последовательности были собраны и депонированы в GenBank (NCBI).

Для изучения продукции биологически активных метаболитов и их экстракции, выделенные из амфипод штаммы культивировали на трех жидких питательных средах, в т.ч. NL-19, SG, ISP2. Штаммы культивировали при температуре 28 °С в течение 4 дней на шейкере при 180 rpm. Культуральная жидкость и биомасса были разделены центрифугированием при 3000 g в течение 5 мин. Вторичные метаболиты экстрагированы этилацетатом из культуральной жидкости. Для биомассы использовали смесь ацетона и метанола в соотношении 1:1. Полученные экстракты были сконцентрированы с помощью роторного испарителя IKA RV–8 (IKA, Germany) при 40 °С , а сухой остаток был растворен в 500 мкл метанола (Sigma, St. Louis, USA) (Sarker et al., 2000). Полученные экстракты были использованы для антибиотических диффузионных тестов против Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas putida KT2440 и Saccharomyces cerevisiae BY4742.

RESULTS

В ходе исследования выделено 42 штамма актинобактерий. Из амфипод вида O. albinus выделено 13 штаммов актинобактерий. Из них 11 штаммов выделены из амфипод, собранных с глубины 80 м, и по одному штамму выделено из рачков, поднятых с глубин 100 и 200 м.

Из O. flavus , выловленных с разных глубин, выделено 29 штаммов. Из них 24 штамма было выделено из амфипод с глубины 200 м, а с глубин 80 и 100 м было выделено четыре и один штамм, соответственно.

Филогенетический анализ участка гена 16S рРНК выявил что 40 из 42 актинобактериальных штаммов принадлежат к роду Streptomyces . Два штамма принадлежат к родам Micromonospora и Pseudonocardia, соответственно (Таблица 1). Оба этих штамма были выделены из O. albinus с глубины 80 м. Полученные данные указывают на разнообразие актинобактерий, ассоциированных с глубоководными амфиподами рода Ommatogammarus .

Из 42 штаммов, выделенных из байкальских эндемичных глубоководных амфипод, только четыре штамма (Streptomyces sp. IB2015P61-1, Streptomyces sp. IB2015P113-15, Streptomyces sp. IB2015P114-1, Streptomyces sp. IB2015P122-1) не проявили антимикробной активности против хотя бы одной тест-культуры.

Остальные

выделенные

штаммы

так и грибов. Число активных выделенных штаммов представлено в таблице 2.

актинобактерий подавляли рост как бактерий,

Table 1. Штаммы актинобактерий, выделенные из глубоководных амфипод рода Ommatogammarus

№	Штамм	Источник выделения	Глубина, м	ID GenBank
1	Streptomyces sp. IB 2015P60-1	O. ablinus	80	KX539267
2	Streptomyces sp. IB 2015P60-1HS	O. ablinus	80	KX539268
3	Streptomyces sp. IB 2015P60-2	O. ablinus	80	KX539269
4	Streptomyces sp. IB 2015P60-2HS	O. ablinus	80	KX539270
5	Streptomyces sp. IB 2015P60-3	O. ablinus	80	KX539271
6	Micromonospora sp. IB 2015P61-1	O. ablinus	80	KX539272
7	Streptomyces sp. IB 2015P61-3	O. ablinus	80	KX539273
8	Pseudonocardia sp. IB 2015P62-1HS	O. ablinus	80	KX531081
9	Streptomyces sp. IB 2015P63-1HS	O. ablinus	80	KX531082
10	Streptomyces sp. IB 2015P64-1	O. ablinus	80	KX531083
11	Streptomyces sp. IB 2015P64-2	O. ablinus	80	KX531084
12	Streptomyces sp. IB 2015P65-1	O. flavus	80	KX531085
13	Streptomyces sp. IB 2015P66-2	O. flavus	80	KX531086
14	Streptomyces sp. IB 2015P67-2	O. flavus	80	KX531087
15	Streptomyces sp. IB 2015P69-1	O. flavus	80	KX531088
16	Streptomyces sp. IB 2015P102-1	O. flavus	100	KX531089
17	Streptomyces sp. IB 2015P104-1	O. albinus	100	KX531090
18	Streptomyces sp. IB 2015P113-1	O. flavus	200	KX539274
19	Streptomyces sp. IB 2015P113-2	O. flavus	200	KX539275
20	Streptomyces sp. IB 2015P113-3	O. flavus	200	KX539276
21	Streptomyces sp. IB 2015P113-4	O. flavus	200	KX539277
22	Streptomyces sp. IB 2015P113-5	O. flavus	200	KX539278
23	Streptomyces sp. IB 2015P113-6	O. flavus	200	KX539279
24	Streptomyces sp. IB 2015P113-7	O. flavus	200	KX539280
25	Streptomyces sp. IB 2015P113-8	O. flavus	200	KX539281
26	Streptomyces sp. IB 2015P113-9	O. flavus	200	KX539282
27	Streptomyces sp. IB 2015P113-10	O. flavus	200	KX539283
28	Streptomyces sp. IB 2015P113-11	O. flavus	200	KX539284
29	Streptomyces sp. IB 2015P113-12	O. flavus	200	KX539285
30	Streptomyces sp. IB 2015P113-13	O. flavus	200	KX539286
31	Streptomyces sp. IB 2015P113-14	O. flavus	200	KX539287
32	Streptomyces sp. IB 2015P113-15	O. flavus	200	KX539288
33	Streptomyces sp. IB 2015P113-16	O. flavus	200	KX539289
34	Streptomyces sp. IB 2015P114-1	O. flavus	200	KX539290
35	Streptomyces sp. IB 2015P114-2	O. flavus	200	KX539291
36	Streptomyces sp. IB 2015P117-1	O. flavus	200	KX539292
37	Streptomyces sp. IB 2015P118-1	O. flavus	200	KX539293
38	Streptomyces sp. IB 2015P119-1	O. flavus	200	KX539294
39	Streptomyces sp. IB 2015P119-2	O. flavus	200	KX539295
40	Streptomyces sp. IB 2015P119-3	O. flavus	200	KX539296
41	Streptomyces sp. IB 2015P119-5	O. flavus	200	KX539297
42	Streptomyces sp. IB 2015P122-1	O. ablinus	200	KX539298

Table 2. Антибиотическая активность штаммов актинобактерий, выделенных из амфипод рода Ommatogammarus в диапазоне глубин 80 – 200 м

Число выделенных штаммов на образец	80 м	100 м	200 м
Число выделенных штаммов	15	2	25
Выделено из O. albinus	11	1	1
Число активных штаммов, в т.ч.	10	1	0
Активны против бактерий	5	1	0
Активны против грибов	9	1	0
Число неактивных штаммов	1	0	1
Выделено из O. flavus	4	1	24
Число активных штаммов, в т.ч.	4	1	21
Активны против бактерий	4	1	16
Активны против грибов	4	1	15
Число неактивных штаммов	0	0	3

DISCUSSION

Как показывают результаты настоящего исследования, из представителей глубоководных эндемичных амфипод озера Байкал выделено 42 штамма актинобактерий. Анализ числа штаммов актинобактерий, выделенных из амфипод, принадлежащих к роду Ommatogammarus, выловленных в диапазоне глубин 80 – 200 м, показывает, что между числом выделенных культур, глубиной, с которой выловлены амфиподы, и самим источником выделения, каких-либо корреляций не наблюдается. В то же время, обнаружены видоспецифические особенности. Так, число культивируемых штаммов актинобактерий, обнаруженных в O. albinus снижается в градиенте глубин от 80 (число штаммов 11) до 200 м (число штаммов 1). В случае O. flavus, число штаммов, напротив, возрастало с глубиной. Это может быть связано с экологией изучаемых видов амфипод, в частности, с их высоким уровнем активности и способности амфипод к активным движениям и миграциям по градиенту глубин (Timoshkin et al., 2001). Упомянутые миграции обусловлены сезонными факторами и/или пищевым поведением.

По результатам полученных материалов обнаружена слабая корреляция между активностью штаммов и глубиной вылова амфипод. Выявлено, что число активных штаммов, выделенных из амфипод, обитающих на глубине 80 м, выше, чем число активных штаммов, выделенных из амфипод, собранных на глубине 200 м. Так, с глубины 80 м проявили антибиотическую активность 93% штаммов, против 88% штаммов, собранных с глубины 200 м.

Данные особенности могут быть обусловлены уменьшением или снижением резистентных способностей бактерий, обитающих в более стабильных условиях озера. Подобное снижение резистентных способностей было обнаружено у некоторых антарктических эукариотических организмов и некоторых термочувствительных гидрозой, которые потеряли способность к синтезу белков теплового шока (Hofmann, 2005; Terza La et al., 2007) при эволюции в стабильных условиях.

Таким образом, с одной стороны - вопрос о том - является ли снижение стресс-ответа и механизмов защиты против бактериальных патогенов результатом эволюции в условиях высокой стабильности, остаётся открытым и требует дальнейшего исследования. С другой стороны известно, что биоразнообразие организмов прибрежной зоны выше, чем разнообразие видов, обитающих в абиссали. Обитание бактерий в области малых глубин связано с высокой вероятностью встречи актинобактерий с известными патогенами и продуктами человеческой жизнедеятельности. В то же время, обитание бактерий вдали от уреза вода и на больших глубинах может повлечь за собой уменьшение числа патогенов, встречаемых в наземных экосистемах, и снижению числа активных штаммов. Следовательно, выделение штаммов актинобактерий с больших глубин и отдалённых от берега областей должно привести к обнаружению специфической (узко направленной) активности бактерий против патогенов животных и специфическим механизмам действия антибиотиков.

Среди животных, населяющих озеро Байкал, наиболее интенсивно изучено микробное сообщество губок. Ранние исследования губок, принадлежащих к родам Swartschewskia, Baicalospongia, и Lubomirskia с помощью классических методов показали, что актинобактерии из родов Streptomyces и Micromonospora являются постоянным компонентом бактериального сообщества. Исследования, проведенные Парфеновой В.В. и др. (2008) показали, что род Micromonospora доминирует среди культивируемых актинобактерий во всех изученных губках из озера Байкал (Parfenova et al., 2008). Несмотря на то, что к настоящему времени проведено множество исследований культивируемых и некультивируемых штаммов актинобактерий, выделенных из воды, осадков, и губок, материалы настоящего исследования являются первым результатом, описывающим разнообразие культивируемых актинобактерий в глубоководных амфиподах озера Байкал. Также настоящее исследование является первым сообщением о выделении актинобактерий, принадлежащих к родам Micromonospora и Pseudonocardia, из байкальских эндемичных амфипод. Ранее из амфипод рода Brandtia sp. выделено 10 штаммов актинобактерий, принадлежащих к родам Aeromicrobium sp., Nocardia sp., Streptomyces sp., а из амфипод вида Pallasea cancellous был выделен один штамм -представитель Nocardia sp. (Axenov-Gribanov et al., 2015).

Известно, что микроорганизмы, ассоциированные с амфиподами, могут разлагать сложные субстраты, например, целлюлозу и хитин (Anderson et al., 2012). Так, амфиподы могут получать дополнительное питание от ассоциированной с ними микрофлоры. Ввиду низкого уровня органического вещества в воде озере Байкал, данное свойство актинобактерий может играть существенную роль в питании амфипод. Также ранее показано, что бактериальная биомасса, образующаяся в детритовых пищевых цепях, является частью энергетического обмена арктических амфипод (Atlas and Busdosh, 1982). Исследованиями Barlocher (1982) показано, что грибные ферменты расщепляют структурные углеводы в кишечнике амфипод Gammarus fossarum (Barlocher, 1982). Кроме того, существует доказательство того, что отдельные амфиподы обладают постоянной и транзиторной микрофлорой, а некоторые глубоководные морские амфиподы из зоны абиссали обладают постоянной микрофлорой, участвующей в питании организма-хозяина (Deming et al., 1981).

Таким образом, результаты данного исследования показывают, что в организмах амфипод рода Ommatogammarus обитают актинобактерии, которые продуцируют соединения с антимикробной активностью. Предполагается, что последние могут оказывать влияние на метаболизм глубоководных амфипод-падальщиков. Кроме того, актинобактерии, выделенные из байкальских эндемичных амфипод, обладают высоким фармацевтическим потенциалом в качестве источников антибиотиков и биологически активных соединений и расширяют понимание взаимоотношений между микроорганизмами и эндемичными амфиподами.

ACKNOWLEDGEMENTS

Исследование проведено при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, в т.ч. проектов Госзадания (№6.382.2014/K, 6.734.2016 DAAD, 6.696.2016 DAAD), гранта РНФ (№ 14-14-00400), РФФИ (№ 14-04-00501, 16-34-00686), грантом Иркутского государственного университета для молодых ученых и немецкой службой академических обменов.