Оценка стрессоустойчивости различных генотипов сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) с помощью биотехнологического метода

В настоящее время существует множество глобальных экологических проблем: сокращение генофонда биосферы, загрязнение окружающей среды, сокращение площади лесов, опустынивание, деградация почв и т. д. В последние годы прослеживается тенденция глобального изменения климата. В связи с этим всем живым организмам, особенно растениям, ведущим прикрепленный образ жизни, приходится адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды.

Образование каллуса – защитная реакция на поранение растительной ткани, а также на изменение эндогенного или экзогенного гормонального баланса. Каллус представляет собой неорганизованно пролиферирующую ткань, состоящую из однородных недифференцированных клеток. Установлено, что способность изолированной ткани к каллусообразованию зависит, прежде всего, от генотипа материнского растения, а также от условий культивирования [1, 2].

Среди преимуществ использования клеточных моделей отмечается скорость ответа, возможность контролирования условий культивирования, в том числе и путем создания искусственных стрессовых ситуаций. В настоящее время есть работы в области физиолого-биохимических процессов клеточных популяций, подтверждающие наличие связи между особенностями каллусогенеза и интактными растениями, в которых показана сохранность биохимической специализации (накопление смолы, фенолов в кал-лусных культурах в зависимости от индивидуальных особенностей исходных деревьев) [3, 4].

Считается, что клеточные культуры in vitro – это удобные, хорошо контролируемые модели, которые могут быть использованы в качестве селекционных, индикационных биотест-систем и для лесных древесных растений. В последнее время появляется все больше исследований, посвященных изучению влияния различных стрессирующих факторов на растительные организмы (тяжёлые металлы, вирусы, низкие и высокие температуры окружающей среды, засоление) с помощью биотехнологического метода [2, 5–11]. Однако исследований по хвойным дре- весным растениям, в частности сосне обыкновенной, мало. Объясняется это, по-видимому, трудностью её использования как объекта биотехнологических исследований из-за высокой степени инфицируемости вводимого в культуру материала, а также из-за содержания большого количества вторичных соединений (фенолов, терпенов и т. д.), которые в изолированных тканях активизируются и ингибируют деление и рост клеток [12].

Цель работы – установить возможность индикации взрослых деревьев сосны обыкновенной на устойчивость к стрессовым факторам с помощью каллусных культур in vitro .

Решаемые задачи :

• ✓    накопление экспериментальных данных об особенностях каллусогенезов различных генотипов сосны обыкновенной;

• ✓    определение наиболее быстрых и доступных для учета реакций каллусогенезов параметров, наглядно их дифференцирующих.

Объекты и методы. В работе использованы деревья сосны обыкновенной, отобранные Н. Ф. Кузнецовой на модельном объекте «Острогожск» (Воронежская обл.). Для получения кал-лусных культур брали стеблевые экспланты молодых побегов размером 1,0–1,5 см. Каллусные культуры получали и выращивали в условиях культуральной комнаты (2 000 лк, 16-часовой фотопериод, 25–26 °С). Для каждого генотипа исходного дерева брали не менее 20 эксплантов. Эксперимент проводился в 3-кратной повторности. Базовой питательной средой служила среда Мурасига и Скуга с половинным составом макросолей [13], гормональное обеспечение осуществляли, используя α -НУК (Sigma, США) в концентрации 2 мг/л и 6-БаП (Sigma, США) – 0,5 мг/л. Углеводное питание обеспечивали 3 %-й сахарозой.

Оценку каллусогенеза проводили визуально с интервалом 5–7 сут по следующим признакам:

• ✓    скорость инициации первичных каллус-ных культур (СК, сут);

• ✓    интенсивность каллусогенеза (ИК, балл) -рост биомассы каллусной ткани по объёму за фиксированный период культивирования по 5-балль-

• ной системе: 1 балл – следы новой ткани; 2 балла – объем каллусной ткани меньше объема экспланта; 3 балла – объем каллуса равен объему экспланта; 4 балла – объем каллусной ткани больше объема экспланта; 5 баллов – интенсивный рост каллусной ткани, в разы превышающий объем экспланта;

• ✓    частота каллусогенеза (ЧК, %) - отношение эксплантов, образовавших каллус, к общему их числу;

• ✓    жизнеспособность клеточных культур -появление (сутки) и скорость распространения поврежденной каллусной ткани. Живая и мертвая каллусные ткани визуально легко различаются: светлая – живая и темно-коричневая – поврежденная. Процесс старения каллусных культур в течение одного цикла культивирования оценивали по 5-балльной системе: 1 балл – появление на каллусе одного небольшого участка мертвой ткани; 2 балла – объем некротической ткани заметно меньше объема живой; 3 балла – объем темно-коричневой ткани равен объему светлой ткани; 4 балла – объем темно-коричневой ткани значительно больше объема светлой; 5 баллов – 100 %-е поражение каллусной ткани (вся ткань темно-коричневого цвета).

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Stadia.

Оценка эффективности каллусогенезов стеблевой ткани сосны обыкновенной в зависимости от генотипических особенностей дерева

№ дерева	Эффективность каллусогенезов
	Частота образования, шт./%	Скорость образования, сут
28	96,2	5
36	81,2	5
14	66,6	5
46	64,2	5
41	50,0	7
11	44,4	10
45	41,6	15
34	33,3	10
8	16,6	15
4	14,2	15

Результаты и обсуждение . В ходе эксперимента было установлено, что одним из наиболее информативных параметров, который можно применять в целях индикации, является ЧК. Все деревья по порядку убывания значений данного признака расположились следующим образом: № 28, 36, 14, 46, 41, 11, 45, 34, 8, 4. Далее исследуемые деревья были разбиты на 2 группы: условно устойчивые (ЧК 96,0–50,0 %) – № 28, 36, 14, 46, 41 и условно чувствительные (ЧК 44,4–14,2 %) – № 11, 45, 34, 8, 4 (таблица).

Отмечена прямая зависимость между частотой каллусогенеза и скоростью инициации первичных каллусов. Культуры, имеющие высокие показатели ЧК (условно устойчивые), характеризовались и высокими показателями их инициации – первые реакции наблюдались на 5–7-е сут, и наоборот – у культур с низкими показателями ЧК (условно чувствительные) первые реакции фиксировались на 10–15-е сут (в 2–3 раза медленнее условно устойчивых). Так, например, у дерева № 28 с самым высоким значением ЧК (96,2 %) первичные каллусы появлялись на 5-е сут, в то время как у дерева № 4 с самым низким показателем ЧК (14,2 %) – только на 15-е сут.

В ходе оценки процесса каллусогенеза по показателю ИК нам удалось выявить наиболее информативные фазы культивирования: начальная и завершающая (рис. 1). Для обеих стадий интенсивность нарастания биомассы клеток выше в группе условно устойчивых деревьев.

Несмотря на наличие разницы по данному показателю между условно чувствительными и условно устойчивыми деревьями, мы пришли к заключению, что для целей индикации предпочтительнее использовать параметр ЧК, тесно связанный со скоростью инициации каллусоге-неза, а не показатель ИК. Это связано с тем, что одной из основных задач настоящего исследования является поиск показателей, более простых по учёту и информативных по проявлению реакций. Кроме того, оценка ИК, осуществляемая либо по балльной системе, либо по массе, не лишена элементов субъективизма в первом случае и достаточно трудоёмка – во втором. К тому же следует учитывать факт, что на этапе экспоненци- ального нарастания биомассы различия в реакции постепенно сглаживаются, вследствие чего признак ИК становится менее информативным [14–16].

В завершающей фазе одного цикла культивирования все клеточные культуры подвержены угнетению ростовых процессов и в дальнейшем – гибели. Одним из ведущих факторов, определяющих ход данного процесса, являются генотипические особенности исходного дерева.

Степень жизнеспособности клеточных культур определяли по наличию или отсутствию повреждённых клеток, их количеству и скорости распространения некротических процессов. Оценку проводили от начала процесса старения ткани до её гибели, применяя признак жизнеспособности по 5-балльной системе (рис. 2).

б

Рис. 1. Эффективность каллусогенезов сосны обыкновенной в зависимости от генотипических особенностей дерева (10-е сут культивирования):

а – дерево № 28 (условно устойчивое);

б – дерево № 4 (условно чувствительное)

Рис. 2. Жизнеспособность каллусных культур стеблевых эксплантов сосны обыкновенной в течение одного цикла культивирования: а – нормальная жизнеспособная каллусная культура (0 баллов);

б – очаги некротической ткани (3 балла); в – объем поврежденной ткани больше объема светлой, жизнеспособной (4 балла); г – 100%-е поражение каллусной ткани (5 баллов)

Установлено, что сроки начала появления первых некротических участков варьировали в широких пределах – от 5 до 30 сут (рис. 3). Момент появления первых культур с единичными очагами погибших клеток – это начало некротических процессов. Срок распространения некрозов ткани также сильно различается (от 5 до 25 сут). Полученные данные говорят о том, что продолжительность жизни культур, относящихся к группе условно устойчивых деревьев, в 2–3 раза больше, чем чувствительных.

Рис. 3. Оценка жизнеспособности каллусных культур стеблевых эксплантов сосны обыкновенной в зависимости от генотипа исходных деревьев

Выявлена определённая связь между признаком частоты каллусогенеза и визуальным проявлением его старения. Культуры с высокими показателями ЧК (50–96,2 %) отличались и большей жизнеспособностью (20–30 сут). Культуры с малыми значениями ЧК (14,2–44,4 %) погибали на 10–15-е сут культивирования.

Выводы. Общая тенденция, наблюдающаяся в реакциях каллусогенезов, направлена на дифференциацию деревьев по отклику на стрессовые условия культивирования. Данный факт является свидетельством высокой индикационной способности каллусогенезов сосны и возможности использования данного метода с целью выбора наиболее устойчивых генотипов. Выявлены наиболее информативные индикационные признаки: скорость инициации каллусов и связанные с ней частота и жизнеспособность каллусных культур в течение одного цикла.