Оценка связи полиморфизмов гена р53 с риском развития злокачественных новообразований у работников производства, сопряженного с радиационным воздействием

Поиск достоверных маркеров риска развития заболеваний, связанных с профессиональной деятельностью человека и проживанием насе- ления в экологически неблагополучных зонах, является одной из наиболее острых проблем современной профилактической медицины. Иони- зирующее излучение (ИИ) считается фактором профессиональной вредности для работников, занятых на производстве, сопряженном с радиационным воздействием. Одним из возможных следствий действия ИИ является увеличение мутационного груза у персонала радиационноопасных производств и проживающего рядом с ними населения, что может выступать фактором, повышающим риск развития онкологических заболеваний [19]. Реакция организма человека на радиационное воздействие определяется многими факторами, в том числе индивидуальной радиочувствительностью. Степень радиочувствительности в существенной мере обусловлена различной генетически детерминированной способностью к поддержанию стабильности генома путем репарации повреждений в ДНК и удаления посредством программируемой клеточной гибели (апоптоза) тех клеток, в которых нарушения генетического аппарата могут привести к злокачественной трансформации. Одним из ключевых генов, обеспечивающих стабильность генома, является ген р53 (ТР53), кодирующий опухолесупрессорный белок р53, вовлеченный в регуляцию клеточного ответа на стрессорные воздействия путем остановки клеточного цикла в контрольных точках для осуществления репарации ДНК либо индукции апоптоза в случае невозможности устранения ее повреждений [5, 7, 11, 23]. Известно, что в ответ на воздействие ИИ активированный белок р53 совместно с белком р21 участвует в остановке клеточного цикла в точке перехода G1/S и запуске репарационных событий [8]. В процессе репарации р53 участвует не только как транскрипционный фактор, но и как структурный белковый компонент репарационного комплекса [20].

Функциональная активность гена р53 варьирует у разных индивидуумов в связи с генетическим полиморфизмом. Из известных более чем 30 полиморфизмов гена р53 функциональное значение имеют экзонный (Arg72Pro) полиморфизм, изменяющий аминокислотную последовательность белка р53, и два интронных: dup16in3 – дупликация 16 пар нуклеотидов (5`-gacctggagggctggg 3`) в 3 интроне) [24] – и замена G>A в 61 паре нуклеотидов в 6 интроне. Полиморфизмы в интронных последователь- ностях приводят к снижению эффективности экспрессии гена и, как следствие, к снижению апоптотического индекса и эффективности репарации ДНК [25]. У больных раком молочной железы (РМЖ), получавших лучевую терапию, было выявлено, что минорные аллели по указанным интронам модулируют влияние экзонного полиморфизма Arg72Pro на радиочувствительность нормальной ткани к ионизирующему излучению [13, 21]. Показана ассоциация минорного аллеля по полиморфизму в 3 интроне с раком легкого [25], РМЖ [18, 24] и колоректальным раком [10]. Полиморфизм в шестом интроне гена р53 менее изучен в плане ассоциаций с злокачественными новообразованиями (ЗНО).

Целью настоящего исследования явилась оценка роли полиморфизмов гена онкосупрессора р53 в формировании предрасположенности к злокачественной трансформации при долговременном радиационном воздействии низкой интенсивности.

Материал и методы

Из включенных в исследование онкологических больных работников Северского химического комбината (СХК) 79 (58 мужчин и 21 женщина) состояли на индивидуальном дозиметрическом контроле. Работники подвергались внешнему и внутреннему облучению. Диапазон доз внешнего облучения для всей группы составлял от 2,28 мЗв до 1 605,1 мЗв (медиана 71,3; интерквартильный размах 25,5–298,4). Для мужчин медиана составила 102,5, интерквартильный размах – 34,4–321,9; для женщин – медиана 40,3, интерквартильный размах – 10,1–70,1. Средняя продолжительность облучения по всей группе – 24,5 года, для мужчин – 26,17 года, для женщин – 17,63 года. Содержание 239Pu в организме колебалось от <0,1 нКи до 68 нКи во всей группе, у мужчин – от 0,1 нКи до 30 нКи, у женщин – от <0,1 нКи до 68 нКи. Все указанные дозы ИИ относятся к диапазону «малых» доз. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 № 2288). От каждого донора было получено информированное согласие на забор

Таблица 1

p53 intron 3 dup 16 (11951–11966)	P53 in 3 F	5’-TGG GAC TGA CTT TCT GCT CTT 3’	Ампликон 180/196 п.н.	Wu X. et al., 2002
	P53 in 3 R	5’-TCA AAT CAT CCA TTG CCT GG 3’
р53 intron 6 (G13494A)	P53 in 6 F	5’-TGG CCA TCT ACA AGC AGT CA 3’	Ампликон 404 п.н.	Wu X. et al., 2002
	P53 in 6 R	5’-TTG CAC ATC TCA TGG GGT TA 3’

Структура праймеров

крови, выделение ДНК и использование её для исследовательских целей.

Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови с помощью протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Для всех обследованных индивидов проведено генотипирование по полиморфизмам dup16 bp (основания 11951–11966) в интроне 3 гена p53, G13494A в интроне 6 гена p53 с помощью ПЦР-ПДРФ анализа согласно описанной методике [25]. Структура праймеров приведена в табл. 1. В качестве популяционного контроля использовали сопоставимые по возрасту выборки онкологически здоровых мужчин (n=195) и женщин (n=193) региона Западной Сибири. В группах популяционного контроля и группах больных с ЗНО для изученных полиморфных вариантов генов наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому при соблюдении равновесия Харди – Вайнберга. При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий χ2 Пирсона. Для отклонения нулевой гипотезы (отсутствие различий) принимали уровни статистической значимости р ≤0,05.

Результаты и обсуждение

Биологическая вариабельность чувствительности организмов к радиационно индуцированному канцерогенезу связана с различной радиочувствительностью, которая, в свою очередь, может зависеть от возраста, обладать определенной ткане- и органоспецифичностью, что в сочетании с молекулярной мультимодальностью активности генов, в том числе обусловленной их полиморфизмом, обеспечивает многообразие патологических реакций, лежащих в основе инициации и прогрессии опухолей различных локализаций [19]. В этой связи на первом этапе мы проанализировали структуру заболеваемости в объединенной группе и при ее разделении по признаку наличия контакта с источниками ИИ (Rad+) или его отсутствия (Rad-) (табл. 2).

Таблица 2

Объединенная группа (n=157), локализация ЗНО, абс. ч.(%)	Rad+ (n=79), локализация ЗНО, абс. ч.(%)	Rad- (n=78), локализация ЗНО, абс. ч.(%)
1.Простата – 27 (17,2) 2.Желудок – 23 (14,6) 3.Толстая кишка – 21 (13,4) 4.Молочная железа – 18 (11,5) 5 . Почки – 16 (10,2) 6 .Легкие – 13 (8,3) 7 .Кожа – 11 (7,0) 8 .Щитовидная железа – 8 (5,1) 9 .Мочевой пузырь – 6 (3,8) 10 .Прочие – 14 (8,9)	1.Простата – 17 (21,5) 2.Желудок – 14 (17,7) 3.Толстая кишка – 10 (12,6) 4 .Молочная железа – 9 (11,4) 5 .Почки – 7 (8,9) 6 .Кожа – 7 (8,9) 7 .Легкие – 4 (5,1) 8 .Щитовидная железа – 2 (2,5) 9 .Мочевой пузырь – 3 (3,8) 10 . Прочие – 6 (7,6)	1.Толстая кишка – 11 (14,1) 2.Простата – 10 (12,8) 3 .Желудок – 9 (11,5) 4 .Молочная железа – 9 (11,54) 5 .Почки – 9 (11,5) 6 .Легкие – 9 (11,5) 7 .Щитовидная железа – 6 (7,7) 8 .Кожа – 4 (5,1) 9 .Мочевой пузырь – 3 (3,8) 10 .Прочие – 8 (10,3)

Частота ЗНО различных локализаций у работников СХК

Мы сравнили распределение аллелей и генотипов по этим полиморфизмам в группах облученных (Rad+) и необлученных (Rad-) больных раком мужчин и женщин, а также провели сопоставление с популяционным контролем. В группе больных мужчин выявлено снижение частоты минорного аллеля по 6 интрону независимо от фактора облучения, по сравнению с контрольной выборкой, что свидетельствует о его защитном эффекте в плане формирования ЗНО (табл. 3). В группе больных, работавших на производствах с воздействием ИИ, не выявлено различий с контролем в распределении генотипов, в то время как в группе необлученных больных частота гомозиготных генотипов по «дикому» аллелю существенно повышена (79,5 % против 60,5 %, р=0,017) при снижении частоты гетерозиготных генотипов (15,9 % против 31,8 %, р(Y)=0,055). У женщин не выявлено статистически значимых различий в распределении изучаемых генотипов и частоте аллелей между контрольной выборкой и группами больных независимо от наличия фактора облучения (данные не представлены). Это дает основания говорить о гендерной (половой) составляющей влияния генетического фактора в развитии ЗНО, с возможной модуляцией этого влияния ИИ.

Наши результаты о защитном эффекте гетерозиготного генотипа по 6 интрону на развитие онкопатологий у необлученных мужчин – работников СХК – согласуются с ранее полученными нами и другими авторами данными о том, что как избыточная, так и недостаточная активность гена (у гомозигот по мажорному аллелю или гомозигот по минорному аллелю соответственно) влияет на эффективность функционирования системы, стабилизирующей геном в условиях,

Таблица 3

	Аллель		Генотип
	1(W)	2 (M)	11(W/W)	12(W/M)	22(M/M)
W/dup16 bp intron 3 (отсутствие dup16 bp –1 (W), dup16 bp – 2 (M))
Контроль (мужчины)	347/390 (0,889)	43/390 (0,113)	153/195 (0,780)	41/195 (0,210)	1/195 (0,010)
Общая группа (облученные и необлученные)	186/208 (0,894)	22/208 (0,106)	83/104 (0,798)	20/104 (0,192)	1/104 (0,010)
Rad+	102/116 (0,879)	14/116 (0,121)	44/58 (0,759)	14/58 (0,241)	0
Rad-	84/92 (0,913)	8/92 (0,087)	39/46 (0,848)	6/46 (0,130)	1/46 (0,022)
G13494C intron 6 (G (MspI+) – 1 (W), C (MspI) – 2 (M)
Контроль (мужчины)	298/390 (0,764)	92/390 (0,236)	118/195 (0,605)	62/195 (0,318)	15/195 (0,077)
Общая группа (облученные и необлученные)	176/204 (0,863)	28/204 (0,137) р=0,045	77/102 (0,755)	22/102 (0,216) р=0,063	3/102 (0,029)
Rad+	99/116 (0,853)	17/116 (0,147) р=0,039	42/58 (0,724)	15/58 (0,259)	1/58 (0,017)
Rad-	77/88 (0,875)	11/88 (0,125) р=0,022	35/44 (0,795) р=0,017	7/44 (0,159) р (Y)=0,055	2/44 (0,046)

Примечание: p(Y) – различия посчитаны с поправкой Йетса (Yates).

Распределение аллелей и генотипов гена р53 у мужчин

когда спектр повреждающих факторов разнообразен и они сравнимы по интенсивности воздействия [2, 25]. В то же время в условиях воздействия ИИ (Rad+) защитный эффект гетерозиготного генотипа не наблюдается. Учитывая, что группы больных отличались только по наличию дополнительного воздействия ИИ, отсутствие защитного эффекта гетерозиготного генотипа у Rad+ лиц можно объяснить тем, что среди факторов, вносящих вклад в формирование опухолей в исследуемых группах, ИИ проявляет себя как доминирующий.

Ионизирующее излучение обладает канцерогенным действием, которое осуществляется в том числе путем повышения общего мутационного фона в клетке и мутаций в гене р53. Мутированный ген р53 часто утрачивает опухолесупрессорные функции, приобретая свойства доминантного онкогена [3]. Поэтому повышенная активность гена р53 при наличии более эффективного аллеля приводит к усиле- нию биологической базовой активности только в том случае, когда наблюдается сохранность этой функции, т.е. при отсутствии мутаций в гене. При повышении мутационного фона под воздействием ИИ и усилении вероятности возникновения мутированного белка р53 с онкогенными свойствами наличие аллеля с высокой активностью становится фактором риска развития ЗНО, а защитный эффект гетерозиготного генотипа нивелируется. Таким образом, полученные данные указывают на актуальность дальнейших исследований на более представительных выборках для подтверждения вклада полиморфизма гена р53 в формирование ЗНО с учетом фактора ИИ.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов МНТЦ №2311 «Оценка риска отдаленных последствий воздействия на население опасных факторов ядерных и химических технологий» и РФФИ 05–04–48482 «Наследственные основы индивидуальной радиочувствительности у человека».