Оценка токсичного действия диоксида серы на химический состав Hypogymnia physodes (L.) Nyl

Лишайники широко используются как биоиндикаторы в экологическом мониторинге, поскольку многие из них проявляют высокую чувствительность к действию таких загрязнителей, как окислы азота [15], фтористый водород, некоторые металлы, окислители, органические соединения. Однако основным токсичным агентом для лишайников остается бесцветный газ – сернистый ангидрид (диоксид серы, SO₂). Сернистый ангидрид преобладает в выбросах подавляющего большинства промышленных предприятий энергетической, металлургической промышленности, а также предприятия по производству серной кислоты и переработке нефти. Доля диоксида серы в структуре выбросов атмосферы составляет 42% [16]. Высокая токсичность этого газа определила многочисленные исследования по воздействию последнего на растения, в том числе лишайники. Практически все исследования воздействия SO 2 на лишайники показывают, что с увеличением степени загрязнения диоксидом серы увеличивается проницаемость мембран, что отражается в более высокой электролитической проводимости водных вытяжек и оттоке ионов калия [3]. Сернистый ангидрид легко разрушает клеточные мембраны и, действуя как акцептор или донор электронов, препятствует нормальному транспорту метаболитов [22]. Проходя внутрь, сернистый ангидрид (причем незаряженные молекулы SO₂ и однозарядные ионы HSO₃^- легче проникают через мембраны, чем двухзарядный ион SO₃^2-) разрушает молекулы ферментов, ассоциированных на мембранах. В клетке диоксид серы также взаимодействует с органеллами – митохондриями и хлоропластами, в том числе и с их мембранами, что приводит к весьма серьезным последствиям: изменяются химические реакции, ответственные за такие процессы, как фотосинтез, дыхание, обмен веществ, производство энергии и т.д. Дальнейшее превращение в клетке сернистого ангидрида в серную кислоту и бисульфит вызывает подкисление внутриклеточной среды, что также отражается на активности физиологических процессов.

На биохимическом уровне сернистый ангидрид вызывает изменение белкового и аминокислотного метаболизма в лишайниках на двух уровнях. Во-первых, сульфит ингибирует белковый синтез, воздействуя на молекулы нуклеиновых кислот [14; 20; 26]. Во-вторых, под влиянием сульфита меняется активность ряда ферментов белкового обмена [19]. Под действием сернистого ангидрида снижается концентрация АТФ [21]. Поскольку аденозинфосфаты играют важную роль в обмене веществ живой клетки и служат источником энергии для синтетических процессов, уменьшение их коли- чества может служить еще одной причиной снижения белковых запасов. В своих исследованиях И.А. Бычек высказал предположение о токсичности этого газа и по отношению к липидам (полярным и нейтральным), что влечет за собой перестройку энергетических процессов, изменение активности фотосинтеза и биохимических показателей мембранных структур, поскольку липиды являются их существенной составляющей [2]. Длительное действие сернистого ангидрида на лишайники уменьшает количество хлорофилла. Разрушение хлорофилла может быть вызвано разрывом связей в хлорофилл-белковых комплексах, а также возникновением свободнорадикального окисления [25].

Исследования по оценке токсичного действия SO 2 на лишайники представляют большой интерес, так как могут являться основой методологии биотестирования [1]. В рамках этого направления становится возможным разработка биологического теста качества среды. Особенно это актуально в силу повышенного внимания к проблемам охраны природы и развития природоохранных мероприятий. Например, И.А. Шапиро (1993) при изучении устойчивости к сернистому газу такого биохимического признака, как содержание азотистых веществ, предложила следующие критерии оценки состояния воздуха: снижение количества азота указывает на длительное действие загрязнения диоксидом серы, а повышение пероксидазной активности может свидетельствовать о его начальных стадиях [14]. Особый интерес представляют разработки по диагностике не только существенных, как правило, уже необратимых изменений, но и первоначальных незначительных отклонений, когда еще возможно вернуть систему в прежнее состояние. В этой связи достаточно информативными могут быть данные Фурье-ИК спектроскопического анализа химического состава лишайников [6]. Возможность точной идентификации типов функциональных групп соединений с помощью Фурье-ИК спектроскопии определяет значительный интерес к использованию этого метода. Последний отражает не только химический состав изучаемого объекта, но и фиксирует основные тенденции изменения химического состава в слоевище, которые могут быть вызваны влиянием экотоксикантов, позволяет оценить не только концентрации загрязнителей, но и определить их порог, степень воздействия, разработать методы ранней диагностики направлений трансформации природных систем, находящихся под влиянием техногенной нагрузки.

В этой связи целью нашей работы явилось спектроскопическое исследование воздействия сернистого ангидрида на слоевище Hypogymnia physodes . В задачи работы входило: разработка методики лабораторного моделирования антропогенного загрязнения атмосферы сернистым ангидридом; интерпретация изменений полученных ИК спектров; проведение количественного спектрального анализа; выявление динамики накопления слоевищем лишайника поллютанта и характера его взаимодействия с органическими компонентами слоевища.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служили образцы среднеустойчивого к атмосферному загрязнению вида лишайника H. рhysodes, который в условиях атмосферного загрязнения проявляет наиболее значительные изменения химического состава [12]. Образцы лишайника были собраны весной 2007 г. в экологически чистой зоне, расположенной в 60 км от г. Твери (окрестности д. Ферязкино Калининского р-на Тверской обл.), которую можно считать фоновой [13].

Моделирование различного уровня антропогенного загрязнения воздуха сернистым ангидридом в лабораторных условиях осуществляли следующим образом (табл. 1). Высушенные образцы H. physodes (1-6), собранные в фоновой зоне помещали в эксикаторы над парами диоксида серы. Для этого предварительно в эксикатор наливали 20 мл серной кислоты (H 2 SO 4 ) различной концентрации, опускали медную проволоку и нагревали на слабом пламени. В результате химической реакции выделяется сернистый ангидрид:

2 H 2 SO 4конц. + Cu CuSO 4 + 2 H ₂ O + SO 2 ^

Образцы H. physodes выдерживали над парами серной кислоты соответствующей концентрации в течение одной–трех недель.

При записи ИК спектров образцов использовали стандартный метод приготовления таблетки с бромидом калия (KBr) [6; 7; 11]. ИК спектры образцов записывали на Фурье-ИК спектрометре «Equinox 55» немецкой фирмы Bruker.

При проведении количественного спектрального анализа использовали английскую версию пакета OPUS-NT спектрометра «Equinox 55», которая позволяет рассчитать оптическую плотность D. Значение D позволяет судить о концентрации исследуемого вещества.

Таблица 1

Схема выполнения эксперимента

Время экспозиции	Концентрация H 2 SO 4 , в %
	3	6	12	24	46	98
	Номер образца
	1	2	3	4	5	6
1 неделя	+	+	+	+	+	+
2 недели	+	+	+	+	+	+
3 недели	+	+	+	+	+	+

Примечание: «+» – ИК спектры данных образцов лишайника были записаны.

При интерпретации ИК спектров образцов лишайника использовали основные отечественные и зарубежные руководства (табл. 2).

Результаты экспериментов. Моделирование различного уровня загрязнения воздуха диоксидом серы в лабораторных условиях дало следующие результаты. Сравнение ИК спектров образцов 1-6 , выдержанных в течение одной недели над парами соответствующего загрязнителя, и образцов этого вида из фоновой зоны показало значительные изменения в химическом составе образца 6. ИК спектр образца 6 демонстрирует существенные изменения сразу в трех частотных областях: появляются полосы на частотах 1424 см^-1, вызванные ассиметричными колебаниями группы SO₂ (сульфаты – (RO)₂SO₂), 873 см^-1 – симметричными колебаниями группы S-O-C и 711 см^-1 -симметричными колебаниями группы SO₂ (сульфоамиды – -SO₂-N=) (рис. 1).

Величина оптической плотности полосы поглощения 1424 см^-1 (D 1424 ) в образце 6 высокая и составляет 0,7, D 873 – 0,19, D 711 – 0,06, что указывает на интенсивный процесс поглощения и накопление экотоксиканта (табл. 3). В то же время в ИК спектре образца 6 исчезают полосы поглощения на частотах 1454 см^-1 (деформационные колебания -CH 2 -), 1654 (Амид I). Данный факт позволяет сделать вывод о чувствительности белкового комплекса к действию загрязнителя данной концентрации. Важно отметить, что ожидаемые признаки повреждения на уровне клетки, которые можно было бы ожидать при выдерживании образца данного вида над парами концентрированной серной кислоты в течение 6-7 суток – побледнение слоевища, вызванное потерей хлорофилла, или омертвление (ослизнение), не наблюдаются. По-видимому, в отличие от некоторых высших растений [4], кратковременное воздействие паров концентрированной серной кислоты менее опасно для лишайника H. physodes. Вероятно, поглощенный диоксид серы успевает окислиться и в определенных пределах подвергнуться восстановлению и нейтрализации без появления повреждений слоевища. Токсичность значительно уменьшается при превращении сульфита в сульфат [4].

Таблица 2

Отнесение некоторых характеристических ИК полос поглощения H.physodes

Волновое число, см- 1	Возможные отнесения	Источник литературы
1654	Амид I	17; 23; 24; 5
1619	С=О	18
1542	Амид II	17; 23; 24; 5
1454	Деформационные колебания -CH 2 -	9; 18
1424	Ассиметричные колебания группы SO2 (сульфаты – (RO) 2 SO 2 )	18
1313	Валентные ассиметричные колебания группы SO2-группы – сульфоны (R-SO 2 R)	8; 9; 12
1266	Амид III	5; 12; 23; 24
1230	Валентные асимметричные колебания SO2-группы в сульфокислотах (R-SO 2- -ОН)	9; 18
1056	Валентные симметричные колебания SO2	9
873	Симметричные колебания группы S-O-C	18
851	Валентные симметричные колебания SO2-группы в сульфокислотах	9; 12; 18
805	Симметричные колебания группы S-O-C	12; 18
780	Симметричные колебания группы S-O-C	12; 18
711	Симметричные колебания группы SO2 (сульфоамиды – -SO 2 -N=)	9; 18
666	Симметричные колебания группы S-O-C, связанные с образованием сульфонов (R-SO 2 R)	9; 18
581	Валентные симметричные колебания SO2-группы в сульфокислотах	9; 18
533	Валентные симметричные колебания SO2-группы в сульфокислотах	9; 18
518	Симметричные колебания группы S-O-C, связанные с образованием сульфонов (R-SO 2 R)	9; 18

Рис. 1. ИК спектры образцов Hypogymnia physodes , выдержанные в течение 1 недели над парами 98% серной кислотой (1), 12% серной кислотой (2) и собранные в фоновой зоне (3)

ИК спектры образцов данного вида, выдержанные над парами серной кислоты меньшей концентрации (6, 12, 24 и 49%) в течение одной недели отличаются незначительным изменением своего химического состава (табл. 3). В основном на ИК спектрах образцов 2-5 со временем экспозиции одна неделя можно наблюдать изменения интенсивности полос поглощения на частотах 1619 (С=О), 1313 (валентные ассиметричные колебания SO 2 -группы – сульфоны (R-SO 2 R)), 805 и 780 см^-1 (симметричные колебания группы S-O-C). Значения D 1313 , D 805 и D 780 в соответствующих образцах данного вида незначительно отличается от соответствующих величин оптической плотности фонового образца. По-видимому, это может свидетельствовать о слабых процессах взаимодействия экотоксиканта при действии паров кислоты данных концентраций с органическими компонентами лишайника в первую неделю экспозиции (табл. 3). Наряду с перечисленными полосами, в ИК спектрах образцов 3, 4 регистрируется слабая полоса поглощения 1542 см^-1 (Амид II). В ИК спектре образца 1 полосы поглощения на частоте 1313 см^-1 нет, в то же время наблюдается увеличение полосы поглощения 1266 см^-1 (Амид III). Появление полосы поглощения Амид II и увеличение интенсивности полосы Амид III вероятно связано с тем, что на свету HSO 3 ^- в хлоропластах может превращаться в органически связанные группы SH^-, которые являются строительным компонентом аминокислот [4], т.е., по-видимому, в какой-то степени токсическое действие сернистого ангидрида оказывается даже полезным. Одинаково низкая интенсивность данной полосы поглощения в образцах 1, 3 и 4 связана с тем, что белки в лишайниках в целом составляют от 1,9 до 3,3% и их количество мало изменяется [8, 10].

При сопоставлении ИК спектров образцов H. physodes 1-6 , выдержанных в течение двух–трех недель над парами загрязнителя, и образца фоновой зоны наблюдается обратная картина. Если в первую неделю экспозиции ИК спектр образца H. physodes 6 демонстрировал наибольшие изменения химического состава лишайника, то ИК спектры данного образца со временем экспозиции две и три недели незначительно отличаются от ИК спектра образца фоновой зоны (табл. 3). Существенные изменения наблюдаются в ИК спектрах образцов H. physodes , выдержанных над парами 3-ной и 6%-ной серной кислоты в течение двух–трех недель (рис. 2). Необходимо отметить, что образцы лишайника, выдержанные над парами 3 и 6% серной кислоты уже на второй неделе экспонирования обесцвечиваются, что, по всей видимости, связано с разрушением хлорофилла. Вероятно, более длительное воздействие (14-21 день) низких концентраций серной кислоты – 3-ной и 6%-ной опасно для лишайника, а процесс поглощения лишайником загрязнителя – сернистого ангидрида – больше зависит от времени экспонирования, чем от его концентрации.

При сопоставлении ИК спектров образца фоновой зоны и образца 1 со временем экспозиции три недели можно обнаружить 2 наиболее чувствительных интервала -1300–1030 см^-1 и 900–500 см^-1 (рис. 2). Увеличение времени экспонирования до трех недель над парами кислоты вносит существенные изменения в ИК спектр образца 1. Вместо полосы поглощения 1266 см^-1 (Амид III) появляются полосы поглощения вызванные возникновением соединений типа сульфокислоты (R-SO 2- -ОН) – 1230 см^-1 (валентные асимметричные колебания SO 2 -группы в сульфокислотах), и увеличивается интенсивность полос поглощения на частотах 851 и 581 см^-1 (валентные симметричные колебания SO 2 -группы в сульфокислотах). Исчезновение полосы поглощения Амид III в ИК спектре образца 1 со временем экспозиции три недели может свидетельствовать об уязвимости белкового компонента лишайника. Регистрируемые в ИК спектре образца изменения связанные с уязвимостью белка, могут, возможно, являться причиной изменения окраски лишайников. Происходит разрушение хлорофилла за счет разрыва связей в хлорофилл-белковых комплексах и протекания свободно-радикальных реакций [25]. С появлением сульфокислот в лишайниковом слоевище связаны и другие изменения в ИК спектрах образца 1 со временем экспонирования три недели: вместо двух полос поглощения на частотах 1075 и 1038 см^-1 появляется одна полоса поглощения на частоте 1056 см^-1.

Таблица 3

Значения оптической плотности (D) различных частотных областей ИК спектров изученных образцов H. physodes

Волновое число, см -1	Время экспонирования	Опыт						Фон
		Концентрация H 2 SO 4 , в %
		3 1	6 1	12      1	24 1	46 1	98
		Номер образца
		1	2	3	4	5	6	0
1654	1неделя	0,38	0,32	0,37	0,39	0,33	-	0,38
	2 недели	0,28*	0,39*	0,43	0,41	0,35	0,35
	3недели	0,25*	0,92*	0,34	0,41	0,45	0,30
1619	1 неделя	0,38	0,31	0,43	0,39	0,33	0,37	0,44
	2 недели	0,27*	0,40*	0,40	0,40	0,32	0,35
	3 недели	0,20*	1,29*	0,31	0,44	0,49	0,35
1542	1 неделя	-	-	0,06	0,12	-	-	-
	2 недели	-	-	-	-	-	0,08
	3 недели	-	-	0,06	-	-	-
1454	1 неделя	0,29	0,24	0,25	0,26	0,25	-	0,24
	2 недели	0,19*	0,29*	0,27	0,25	0,27	0,25
	3 недели	0,20*	0,24*	0,24	0,26	0,30	0,22
1424	1 неделя	-	-	-	-	-	0,7	-
1313	1 неделя	-	0,24	0,25	0,26	0,25	0,29	0,31
	2 недели	-	0,34*	0,33	0,32	0,26	0,29
	3 недели	-	0,79*	-	0,30	0,32	0,25
1266	1 неделя	0,35	0,28	0,28	0,27	0,26	0,24	0,25
	2 недели	-	0,32*	0,32	0,29	0,30	0,29
	3 недели	-	0,29*	0,36	0,31	0,35	0,23
1230	2 недели	0,49*		-	-	-	-
	3 недели	0,39*	-	0,35	-	-	0,22	0,21
1056	2 недели	0,65*	-	-	-	-	-	-
	3 недели	0,85*	-	0,77	-	-	-
873	1 неделя	-	-	-	-	-	0,19	-
	2 недели	0,04*	-	-	-	-	-
	3 недели	0,06*	-	-	-	-	-
851	1 неделя	-	-	-	-	0,01	-	-
	2 недели	0,06*	-	-	-	0,01	-
	3 недели	0,06*	-	-	-	-	-
805	1 неделя	0,03	0,02	0,05	0,02	0,02	0,01	0,02
	2 недели	-	0,02*	0,05	0,02	0,01	0,04
	3 недели	-	0,03*	0,01	0,02	0,03	0,01
780	1 неделя	0,02	0,02	0,06	0,03	0,03	0,04	0,08
	2 недели	-	0,05*	0,05	0,05	0,02	0,04
	3 недели	-	0,31*	0,01	0,04	0,04	0,04
711	1 неделя	-	-	-	-	-	0,06	-
666	3 недели	0,07*	0,17*	-	-	-	-	-
581	1 неделя	-	0,10	-	-	-	-	-
	2 недели	0,23*	0,11*	-	-	-	-
	3 недели	0,18*	0,14*	0,16	-	-	-
533	3 недели	0,12*	-	-	-	-	0,09	-
518	1 неделя	-	-	-	-	-	-	0,09
	2 недели	-	0,09*	-	-	-	-
	3 недели	-	0,22*	-	-	-	-

Примечание: * – изменение цвета (пожелтение); «-» – отсутствие полос поглощения в ИК спектрах.

В олновое число, см

Рис. 2. ИК спектры образцов Hypogymnia physodes :

1 – собран в фоновой зоне; 2 – 4 – экспонированы над 3%-ной серной кислотой в течение одной недели (2), двух недель (3) и трех недель (4); 5 – 6 – экспонированы над 6%-ной серной кислотой в течение одной недели (5), двух недель (6) и трех недель (7)

При сравнении ИК спектров образца 2 со временем экспонирования две и три недели и образца фоновой зоны обнаружены изменения на частотах 1313, 782 и 518 см-1, связанные с возникновением соединений типа сульфонов (R-SO2R) [12, 18]. С увеличением времени экспонирования до трех недель значения D1313 и D782 в ИК спектре образца 2 увеличиваются от 0,24 до 0,79 и 0,02 до 0,31 соответственно (рис. 3). К трем неделям экспонирования величины D1313 и D782 оказываются максимальными. Существенно и увеличение значения D1619 – в четыре раза – 1,29. Увеличение интенсивности последней полосы, по-видимому, связано с началом деструкционных процессов. Более того, в ИК спектре образца 2 со временем экспозиции три недели, помимо отмеченных изменений, появляется дополнительная полоса поглощения на частоте 666 см-1 (симметричные колебания группы SО2 в сульфонах). Величина D666 в ИК спектре образца 2 со временем экспозиции 3 недели высокая – 0,12.

1 4 D 1619

1,0

D 1313

D 780

0,4 1        —*  1 неделя

0,7

0,5

0,0

0,2

—▼— 2 недели

—■ — 3 недели

0 ,0

0123456 01234560123456

№ образа

Рис. 3. Изменение величины оптической плотности (D) некоторых полос поглощения в образцах 1-6

Таким образом, Фурье-ИК спектроскопическое исследование химического состава образцов H. physodes, испытавших воздействие паров серной кислоты различной концентрации в течение одной–трех недель, показало, что определяющим фактором для лишайников, по-видимому, в первую очередь является время экспозиции, а не концентрация данного поллютанта. ИК спектры образцов 1-5 со временем экспозиции одной неделя демонстрируют незначительные изменения. Существенными являются изменения в ИК спектре образца, выдержанного над парами 98%-ной серной кислоты в течение 7 суток. Однако, вероятно, для лишайника данные изменения химического состава не являются необратимыми, не наблюдаются даже ожидаемые внешние морфологические изменения. Появление полос поглощения в ИК спектре образца 6 со временем экспозиции одна неделя, ответственных за наличие сульфатов -(RO) 2 SO 2 (1424 см^-1), свидетельствует о низкой токсичности поглощенного токсиканта, поскольку последний в первую неделю экспозиции успевает окислиться и, в определенных пределах, подвергнуться восстановлению и нейтрализации.

Опасным для лишайника H. physodes оказывается долговременное воздействие (14-21 день) низких концентраций кислоты – 3-ной и 6%-ной. Если в первую неделю экспозиции ИК спектры образцов 1-2 демонстрировали незначительные изменения, то в последующее время ИК спектры этих образцов свидетельствуют о продолжительной реакции, сопровождающейся видимыми морфологическими изменениями – побледнением и пожелтением. В этой связи среднеустойчивый к атмосферному загрязнению вид H. physodes лучше использовать в качестве индикатора низких концентраций за-

Вестник ТвГУ. Серия «Биология и экология». Вып. 7, 2008 грязнителя в атмосфере. Хроническое воздействие экотоксиканта низких концентраций приводит к накоплению их слоевищем с образованием соединений типа сульфонов - R-SO₂R (1313, 782, 666 и 518 см^-1) и сульфокислот - R-SO_2—ОН (1230, 1056, 851 и 581 см^-1) в количестве, превышающем способность ткани к ее детоксикации при нормальном метаболизме, вызывая серьезные, возможно уже необратимые, физиологобиохимические изменения. На основе химических особенностей образующихся в лишайнике соединений [18] под влиянием поллютанта, а также степени вызываемой ими морфоструктурных изменений можно предложить следующий ряд токсичности данных типов соединений для лишайника:

сульфооксиды > cульфокислоты > сульфоны > сульфаты

(-S=O)        (-SO 2 -ОН)      (R-SO 2 R)    (RO) 2 SO 2

Воздействие малых доз экотоксиканта, его накопление слоевищем и преобразование в природных условиях может быть очень длительным процессом. Весьма редко можно встретить длительное воздействие высоких доз эктоксиканта, как это имеет место в нашем эксперименте. Однако исследование токсичного действия сернистого ангидрида на химическую структуру лишайника методом Фурье-ИК спектроскопии позволит путем сопоставления экспериментальных данных с природными системами прогнозировать состояние и уровень жизнедеятельности лишайникового слоевища. Информация о накопленном слоевищем экотоксиканте, форме его взаимодействия с химическими компонентами лишайника во времени может полезна для регистрации качественного и количественного загрязнения атмосферы, а также ранней диагностики уровня жизнедеятельности лишайникового слоевища.

В дальнейшем целесообразно проведение дополнительных спектральных исследований, которые позволят выяснить влияние других загрязнителей атмосферы на химическую структуру лишайника, например соединений хлора – HCl.

Tver State University

Methodology of experiments aimed to model different level of atmosphere pollution by sulfur anhydride was proposed. The interpretation of changes of IR-spectrums of examples of Hypogymnia physodes (L.) Nyl, seasoned under fallows of sulfuric acid of different concentration during 1-3 weeks. It was determined that short-term influence (until 7 days) of fallows of sulfuric acid of high concentration is less harmful for lichens, than long term influence (14-21) of low concentration of sulfuric acid 3-6%. Rank of toxicity for different types of lichens was developed.