Оценка устойчивости яблони к гипертермии на основе перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы защиты

В последние годы период летней вегетации сопровождается жесткими погодными аномалиями: продолжительная гипертермия и засуха. Многие сорта, отселектированные ранее, в годы относительной стабильности климата, реагируют на новые по срокам наступления и интенсивности абиотические стрессы резким снижением биологической продуктивности. В связи с этим, в ходе селекционной работы существует необходимость создания генотипов, сочетающих комплекс хозяйственно ценных признаков с высоким адаптационным потенциалом. При этом необходимо обращать внимание на механизмы действия стрессовых факторов на растительные организмы, что без изучения физиологобиохимических процессов сделать невозможно. Перспективным направлением является определение четко выраженных физиолого-биохимических реакций растений в ответ на искусственно-моделированное стрессовое воздействие.

Как известно, реакции растений на изменившиеся условия среды являются комплексными, включающими изменения биохимических и физиологических процессов, и в основном эти изменения, как правило, носят неспецифический характер [1]. Одной из таких неспецифических реакций на неблагоприятные воздействия, следует отнести изменение свойств мембран, что связано с перестройками в их структуре. Это в значительной мере касается липидов. Наблюдаются сдвиги в соотношении различных групп жирных кислот, изменяется степень их ненасыщенности, возрастает уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) [2]. Согласно литературным данным, независимо от вида растений в условиях действия различных стрессоров наблюдается развитие ПОЛ, что нарушает целостность клеток и снижает их функциональность, вплоть до гибели [3,4.]. Об интенсивности перекисного окисления липидов мембран можно судить по ряду образующихся при этом веществ: гидроперекиси, малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты и др. [5].

Ограничение процессов окисления и поддержание структурно-функционального состояния мембран в основном осуществляется за счет работы антиоксидантной системы защиты: супероксиддисмутаза, пероксидаза, каталаза, полифенолоксидаза и др. [6]. Также мощным защитным механизмом, позволяющим растению адаптироваться к стрессу, является аккумуляция низкомолекулярных антиоксидантов, называемых еще совместными осмолитами: пролин, глутатион, аланин, бетаин, глицин-бетаин и др. [7,8]. В частности, при засухе пролин не только понижает водный потенциал клеток, восстанавливая тем самым водоснабжение, но и защищает ферменты от инактивации, обеспечивает целостность структурных белков, сохраняет функциональную активность клеточных мембран [9].

Цель исследований состояла в проведении оценки генотипов яблони на устойчивость к гипертермии на основе активности антиоксидантной системы защиты и интенсивности процессов липопероксидации.

Объектами изучения служили четыре генотипа яблони: Имрус, Ветеран, Орлик, Уэлси. Условия гипертермии создавали, помещая однолетние побеги указанных сортов в термостат Binder BD23 на один час при температуре +50°С. Контролем служили побеги растений без воздействия стресса. Для анализа отбирали пятые листья с апикальной части побега.

Содержание пролина определяли по реакции с нингидриновым реактивом [10]. Значение содержания аминокислоты рассчитывали с помощью калибровочной кривой, построенной для чистого пролина при длине волны ʎ=520нм. Содержание пролина выражали в мг на кг сырой массы. Для анализа интенсивности перекисного окисления липидов определяли количество малонового диальдегида. Для этого использовали качественную реакцию с тиобарбитуровой кислотой [11]. Расчет проводили с использованием молярного коэффициента экстинции (1,56 · 10⁵ М^-1·см^-1) при длине волны ʎ=535 нм. Содержание МДА выражали в мкМ/г сырой массы. Для определения активности супероксиддисмутазы использована методика с использованием нитросинего тетразолия [12].

В результате анализа по определению интенсивности ПОЛ мембран показано увеличение накопления в клетках малонового диальдегида, как конечного продукта липопероксидации. Согласно исследованиям других авторов увеличение ПОЛ мембран в условиях действия стресса происходит, как правило, за счет излишнего образования активных форм кислорода, которые инициируют свободно-радикальные процессы [4,13,14].

Наибольшую степень перекисного окисления мембранных липидов в условиях теплового шока имели генотипы Уэлси и Орлик. Содержание в листьях конечного продукта липопероксидации мембран – малонового диальдегида в этих сортах увеличивалось на 60 и 46%, соответственно, против бесстрессовых вариантов. Данные по изменению содержания малонового диальдегида представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 – Содержание малонового диальдегида в листьях Malus domestica L

В то же время, в листьях растений яблони сортов Ветеран и Имрус количество МДА после часового воздействия повышенной температурой увеличивалось на 20 и 26%. Меньшее образование конечного продукта липопероксидации (МДА) у генотипов Имрус и Ветеран по сравнению с Орликом и Уэлси, возможно, связано с более интенсивным увеличением под воздействием стресса активности антиоксидантной системы защиты, ответственной за утилизацию активных форм кислорода. Анализ активности супероксиддисмутазы в листьях растений показал, что у генотипов Имрус и Ветеран, под влиянием гипертермии, активность СОД увеличилась в большей степени, чем у Уэлси и Орлика (рис.2). Так активность фермента в сортах Имрус и Ветеран под действием теплового шока по сравнению с контрольными вариантами увеличилась, соответственно, в 2 и 3 раза, тогда как у Орлика и Уэлси в 1.3 и 1,4 раза.

Рисунок 2 – Активность супероксиддимутазы (СОД) в листьях Malus domestica L

Более низкое увеличение значений СОД у Орлика и Уэлси, по-видимому, связано с частичным ингибированием активности данного фермента повышенной концентрацией АФК. При окислительном стрессе антиоксидантные ферменты могут инактивироваться высоким содержанием АФК и для восстановления их синтеза или работы требуется определенное время. В этом случае, на первый план выходят низкомолекулярные метаболиты и в частности пролин [8]. Так, среди совместимых метаболитов, аккумулирующихся в растениях при стрессах, только для пролина показан эффект «тушения» синглетного кислорода, образующегося в первые часы действия стрессора [15].

В наших исследованиях наибольшим накоплением аминокислоты пролин в условиях действия стресса характеризовались генотипы Уэлси и Орлик. Содержание пролина в данных сортах увеличилось на 43 и 70% по отношению к контролю, тогда как у Ветерана и

Имруса на 19,5 и 25%. Значительное увеличение пролина в сортах Уэлси и Орлик могут свидетельствовать о стрессовом состоянии растений, тогда как Ветеран и Имрус, по-видимому, еще не достигли «шокового» порога. Пролин под влиянием стресса накапливается, как правило, для нейтрализации активных форм кислорода [9]. Увеличивая биосинтез пролина, растение пытается уйти от воздействия стресса. Поэтому, чем интенсивней он накапливается, тем сильнее влияние стресса на организм. Исходя из этого, можно говорить о наличии некоторой устойчивости к гипертермии у генотипов Имрус и Ветеран (рис. 3).

Имеются также сведения, что при действии гипертермии пролин и его интермедиат (пирролин-5-

Рисунок 3 – Содержание свободного пролина в листьях Malus domestica L

В результате исследований по определению активности антиоксидантной системы и интенсивности процессов ПОЛ показано, что генотипы яблони Уэлси и Орлик обладают меньшей устойчивостью к действию теплового шока, чем Ветеран и Имрус. В связи с этим генотипы Имрус и Ветеран можно использовать в качестве доноров устойчивости при ведении селекции яблони на устойчивость к гипертермии.