Оценка влияния предварительной алкоголизации на активность микросомальных фракций печени крыс in vitro

DOI:

ББК 54.13:54.194

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АЛКОГОЛИЗАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ МИКРОСОМАЛЬНЫХ ФРАКЦИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС IN VITRO

Назар Андреевич Осадченко

Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград, Российская Федерация

Лилия Петровна Кнышова

Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоградский медицинский научный центр, г. Волгоград, Российская Федерация

Анна Михайловна Доценко

Волгоградский государственный медицинский университет, Волгоградский медицинский научный центр, г. Волгоград, Российская Федерация

Александр С. Тарасов

Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград, Российская Федерация

Анатолий Трофимович Яковлев

Волгоградский государственный медицинский университет, г. Волгоград, Российская Федерация 58                                     Вестник ВолГУ. Серия 11, Естественные науки. 2018. Т. 8. № 1

Введение. Печень – самая крупная железа пищеварительного тракта. Ряд метаболических реакций, протекающих в ней, лежит в основе энергетического и пластического обменов в живом организме. Печень участвует в синтезе белков, в выработке веществ для пищеварения, в обезвреживании токсических продуктов.

В процессе детоксикации участвует локализованная в мембранах эндоплазматического ретикулума система микросомального окисления [1]. К группе микросомальных ферментов относят специфические оксидазы, различные гидролазы и ферменты конъюгации [3]. Система обезвреживания включает множество разнообразных ферментов, под действием которых практически любой ксенобиотик может быть модифицирован. В метаболизме ксенобиотиков могут принимать участие ферменты почек, легких, кожи и ЖКТ, но наиболее активны они в печени.

В последнее время в большинстве исследований для учета вклада биотрансформации в биологическую активность и токсичность ксенобиотиков используют фракции микросом печени – супернатанта после центрифугирования гомогената печени при 9000 g (фракции S9), которая в десятки раз повышает активность ферментов семейства цитохрома Р-450 [5]. Современные исследования метаболизма ксенобиотиков часто проводятся с использованием фракции S9 – продукта центрифугирования гомогената тканей печени [6]. В ряде случаев перед подготовкой фракции необходимо применение индукторов, одним из которых может быть этанол, влияющий на экспрессию и активность NAD-зависимых оксидоредуктаз и некоторых изоферментов системы цитохрома P450.

Цель исследования – оценить влияние хронической алкоголизации крыс на общую функциональную активность ферментативных систем гепатоцитов.

Материалы и методы. Работа выполнена на 24 крысах-самцах линии Вистар (280–350 г), содержавшихся в НИИ фарма- кологии ВолгГМУ. Животные были распределены на 2 группы: контрольную, содержавшуюся на стандартном водно-пищевом рационе, и экспериментальную с 15 % этанолом как единственным источником жидкости [2]. Алкоголизацию животных экспериментальной группы проводили в течение 2-х недель. Для забора биологического материала животных наркотизировали однократным внутрибрюшинным введением хлоралгидрата в дозе 400 мг/кг, после чего брюшную полость вскрывали, портальную вену изолировали и катетеризировали для подключения перфузионной системы, состоящей из перистальтического насоса, емкости с перфузионным раствором, который представлял собой 0,1 М фосфатно-солевой буфер (PBS, pH=7,4). Об эффективности перфузии судили по изменению окраски и консистенции печени. По окончании перфузии животных умерщвляли, печень извлекали, измельчали и гомогенизировали в PBS (1:4), после чего полученные гомогенаты центрифугировали при 9000 g в течение 20 минут. Определение активности ферментативных систем проводили в 96-луночных планшетах, в лунки которых вносили по 50 мкл супернатанта и 200 мкл среды RPMI, содержащей феноловый красный в качестве кислотно-основного индикатора. В качестве негативного контроля использовали супернатант, прокипяченный при 100 °С в течение 20 минут [5]. Планшеты помещали в шейкер-инкубатор (500 об/мин, 37 °С) на 30 минут, затем определяли абсорбцию образцов при 415 нм, что близко к максимуму поглощения кислотной формы фенолового красного. Статистическую обработку производили в программе GraphPad Prism 5.0 по U-критерию Манна – Уитни.

Результаты и исследования. Нарушения компенсаторных механизмов организма, характеризующиеся сдвигами концентрации водородных ионов, приводят к различным нарушениям кислотно-основного равновесия. Смещение кислотно-основного равновесия в кислую сторону, происходящее при работе ферментативных систем живых клеток, широко используется при постановке микротитраци-онных тестов.

В ходе оценки активности ферментативных систем гепатоцитов на фоне хронической алкоголизации было обнаружено достоверное увеличение в 3,5 раза абсорбции кислотной формы фенолового красного в лунках планшета, содержащих фракцию S9 крыс, подвергнутых алкоголизации (рис., p < 0,001). Данные изменения могут быть связаны с индукцией цитоплазменных оксидаз, а также микросомальных оксигеназ и ряда изоферментов систем цитохрома P450.

Полученные результаты указывают на то, что хроническая алкоголизация может изменять экспрессию и активность окисдоредуктаз печени, что может приводить к изменению биотрансформации лекарственных средств-субстратов данного класса ферментов.

Выводы. Обнаружено статистически значимое увеличение ферментативной активности фракции S9, полученной от крыс, подвергнутых хронической алкоголизации, связанное с индуцирующим действием этанола как на микросомальные, так и на цитоплазменные ферменты.