Оценка воздействия эндогенного мелатонина на функциональную активность регуляторных Т-клеток при беременности

Регуляторные Т-лимфоциты (Treg), как центральные медиаторы иммунологической толерант- ности, играют решающую роль во многих аспектах иммунных реакций. Они участвуют в контроле иммунного гомеостаза, предупреждая избыточную активацию иммунной системы, и, как следствие,

препятствуют развитию аутоиммунных и аллергических процессов, реакций отторжения трансплантата [Saito et al., 2010; Shevach, Thornton, 2014; Kanamori et al., 2016; Jeffery et al., 2016]. Важную роль регуляторные Т-лимфоциты играют и в развитии беременности: эффективная дифференцировка и активация этой клеточной субпопуляции является одним из ключевых механизмов формирования толерантности материнского организма к генетически чужеродному для нее (полуалл оген-ному) плоду [Wu et al., 2014]. Cо снижением численности и активности Treg ассоциированы различные патологии гестационного периода, такие как невынашивание беременности или развитие преэклампсии [Steinborn et al., 2012]. В связи с этим регуляция данной клеточной субпопуляции привлекает пристальное внимание исследователей.

Одним из потенциальных регуляторов Treg является эпифизарный гормон мелатонин. С одной стороны, данная субпопуляция должна быть чувствительна к действию мелатонина: известно, что Treg, как и др угие ли мфоциты, экспрессируют специфические мембранные рецепторы для гормона, МТ1 и МТ2 [Slominski et al., 2012], а ключевой дифференцировочный фактор и маркер Treg, FoxP3 находятся под контролем внутриклеточного рецептора для мелатонина, RORα [Lardone et al., 2011]. С другой стороны, уровень мелатонина существенно возрастает в ходе беременности [Tamura et al., 2008]. Такое возрастание неизбежно должно сказываться на развитии и функционировании Treg, особенно учитывая, что все мелатониновые рецепторы имеют разную аффинность связывания гормона и, следовательно, мелатонин-зависимая регуляция Т-клеток чувствительна к концентрации гормона. Связь мелатонина с активностью Treg показана в настоящее время для онкологических заболеваний [Carrillo-Vico et al., 2013], а также для аутоиммунных патологий, в частности, у пациентов с системной красной волчанкой [Medrano-Campillo et al., 2015] или у животных в модели экспериментальных аутоиммунных энцефаломиелитов [Alvarez-Sanchez et al., 2015].

Данных по влиянию мелатонина на дифференцировку Treg при беременности нет, несмотря на очевидную актуальность этой проблемы, определяемую чувствительностью Тreg к действию мелатонина и изменением концентрации гормона в ходе гестации. В связи с этим целью исследования было сопоставление содержания в периферической крови Treg и основного продукта данной клеточной субпопуляции с уровнем мелатонина, и экспрессией мелатониновых рецепторов, а также, в эксперименте in vitro , определение вклада эндогенного мелатонина в дифференцировку Treg в условиях поликлональной активации CD4⁺Т-лимфоцитов.

Материал и методы исследования

В работе использовали лейкоциты женщин, находящихся в I (средний возраст 28.05±4.70 лет, n=20) и III (средний возраст 33.10±6.61 лет, n=10) триместрах беременности, и лейкоциты здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (средний возраст 31.80±6.43 лет, n=10). Указанные сроки гестации выбраны как наиболее критичные в плане индукции спонтанных абортов [Ширшев, 1999] и развития преэклампсии [Payne, Magee, von Dadelszen, 2011], соответственно. Кроме того, эти периоды отличны друг от друга по уровню мелатонина в крови [Tamura et al., 2008]. От всех доноров получено информированное согласие на участие в исследовании. Учитывая суточные колебания уровня мелатонина в крови, забор крови во всех исследуемых группах осуществлялся в одно и то же время (с 8 до 9 утра). Лейкоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1.077 г/см3) («Pharmacia», Швеция). В работе использовали суспензию мононуклеарных клеток, а также CD4+ Т-лимфоциты, фракционированные на иммуномагнитных бусах с помощью соответствующей системы для выделения (“R&D Systems”, США). CD4+ Т-клетки культивировали 48 ч. в присутствии аутологичной сыворотки (как источника эндогенного мелатонина) в среде RPMI 1640 (“Gibco. Thermo Fisher Scientific”, США) с добавлением 1 мМ HEPES (“Sigma-Aldrich”, США), 2 мМ L-глутамина (“Serva”, Германия) и 40 ед/мл гентамицина (“Pharmacia”, Швеция) при 37°С и 5% СО2 в условиях поликлональной активации (система для активации на основе моноклональных антител к CD3/CD28, “Invitrogen”, США). За час до активации в культуру вносили ингибитор мембранных мелатониновых рецепторов (МТ1/MT2) – лузиндол (“R&D Systems”, США). Блокада ядерно-го рецептора для мелатонина RORa на данном этапе не использовалась, поскольку аффинность его с мелатонином на 2.5 порядка ниже аффинности мембранных мелатониновых рецепторов [Slominski et al., 2012] и, теоретически, он не должен быть чувствителен к физиологическим концентрациям мелатонина. Уровень мелатонина в сыворотке крови оценивали иммуноферментным анализом (“IBL International”, Германия). Экспрессия клетками транскрипционного фактора FoxP3 определялась ex vivo и по окончании 48часового культивирования (проточной цитометрией с использованием моноклональных антител: ан-ти-CD4*FITC, анти-FoxP3*PE (“Novus Biologicals”, “R&D Systems”, США)). Синтез ключевого цитокина исследуемой субпопуляции – TGFP, оценивался по его уровню в культуральных супернатантах (иммуноферментным анализом, “Biolegend”, США). Также ex vivo определялась экспрессия ключевых рецепторов для мелатонина: мембранного МТ1 и внутриклеточного RORα (проточной цитометрией, с использованием соответствующих моноклональных антител: анти-CD3*PerCP, анти-Melatonin Receptor 1B*Alexa Fluor, анти-CD4*FITC, анти-RORα*PE (“Novus Biologicals”, “R&D Systems”, США)). Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли. Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 48 ч. культивирования, составляла 95–98%. Статистический анализ проводили с использованием непараметрических Т-критерия Вилкоксона и U-критерия Манн-Уитни, поскольку выборочное распределение данных не соответствовало нормальному. Описательные характеристики количественных признаков представлены в виде медианы с нижней и верхней квартилью – Me (LQ; UQ). Степень взаимосвязи признаков оценивалась с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r).

Результаты и их обсуждение

Исследование ex vivo выявило повышение уровня CD4⁺FoxP3⁺ Т-клеток и концентрации сывороточного TGF β в ходе беременности (табл. 1).

Таблица 1

Оценка уровня Treg и сывороточного TGF β при беременности ex vivo (Mе (LQ; UQ))

Показатель	Небеременные женщины	I триместр беременности	III триместр беременности
Процент CD4+FoxP3+	0.16 (0.05;	0.21 (0.15;	0.46 (0.34;
Т-клеток, %	0.24)	0.27)	0.62)*#
Концентра-	5309.89	12 355.21	11 948.75
ция TGF β в	(4135.67;	(10 277.75;	(10 277.75;
сыворотке крови, пг /мл	8832.55)	15 697.22)*	1 2 626.19) *

Примечан ие. *p <0.05 в сопоставлении с показателем у небеременных женщин, #p<0.05 в сопоставлении с показателем в I триместре.

Наряду с этим наблюдалось увеличение концентрации мелатонина в сыворотке крови в III триместре (табл. 2). В целом, полученные результаты согласуются с имеющимися литературными данными: отмечено значительное увеличение циркулирующих клеток Treg во время беременности как у человека [Somerset et al., 2004], так и у мышей [Aluvihare, Kallikourdis, Betz, 2004], с последующим снижением после родов. Подобные закономерности в ходе гестации продемонстрированы и для сывороточной концентрации мелатонина [Tamura et al. 2008]. При оценке связей между уровнями мелатонина и Treg в крови достоверной корреляции не выявлено, что может быть связано с относительно небольшим размером исследуемой группы, однако важно отметить, что тенденция изменения у этих факторов при беременности одна.

Анализ уровня экспрессии рецептора МТ1 не выявил различий в группах беременных и небеременных женщин (табл. 2). Однако установлено достоверное снижение в течение беременности процента CD4⁺ Т-клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор ROR α (табл. 2). Возможно, ингибирование ROR-опосредованной активации транскрипции генов-мишеней происходит за счет взаимодействия RORα с FoxP3, что, в конечном итоге, оказывает влияние на регуляцию воспалительных реакций и развитие лимфоцитов [Ziegler, Buckner, 2009]. Помимо этого, косвенное влияние на RORα может оказывать и мелатонин.

Таблица 2

Уровень сывороточного мелатонина, экспрессия мелатонинового рецептора и ROR α ex vivo (Mе (LQ; UQ))

Показатель	Небеременные женщины	I триместр беременности	III триместр беременности
Концентрация мелатонина в сыворотке крови, пг/мл	21.37 (18.69; 38.47)	19.55 (17.70; 34.90)	48.59 (42.41; 135.85)*#
Процент CD3+МТ1+ - клеток,%	1.48 (0.96; 5.22)	1.57 (1.03; 4.22)	3.45 (2.38; 5.49)
Процент CD4+RORα+ -клеток, %	1.03 (0.50; 1.58)	0.94 (0.76; 1.35)	0.50 (0.44; 0.78)#

Примечание. *p<0.05 в сопоставлении с показателем у небеременных женщин, #p<0.05 в сопоставлении с показателем в I триместре.

Оценка непосредственного вклада эндогенного мелатонина в индукцию Treg проводилась in vitro в условиях поликлональной активации (анти-CD3/CD28) в присутствии аутологичной сыворотки с помощью блокады мелатониновых рецепторов. При этом наблюдалось увеличение процента CD4⁺FoxP3⁺ Т-клеток только у небеременных, и блокада мелатонин-зависимых сигналов это повышение не отменяла (табл. 3). При беременности же процент CD4⁺FoxP3⁺ Т-клеток не менялся в ответ на активацию, однако в присутствии ингибитора мелатониновых рецепторов наблюдалось достоверное снижение процентного содержания этих клеток по сравнению с уровнем активированной культуры (табл. 3). Аналогичные закономерности выявлены для небеременных и беременных III триместра при исследовании супернатантов культур активированных CD4⁺Т-клеток. В то же время, у небеременных женщин выявлена отрицательная корреляционная связь между процентным содержанием рецептора ROR α и концентрацией TGF β в культуральных супернатантах: и in vitro (r s = –

0.734, p < 0.05), и на фоне ингибитора (r s = – 0.734, p < 0.05).

Таким образом, проведенные исследования показали, что в крови уровень и активность Тreg изменяются однотипно с мелатонином, а в ответ на активацию в культуре – противоположно.

Это может означать, что мелатонин не играет ведущей роли в контроле Тreg на системном уровне, или его эффекты in vivo опосредуются и нивелируются другими гормонами гипоталамо-гипофизарно-адренальной и/или гонадальной осей, многие из которых сами являются эффективными иммуномодуляторами [Gupta, Haldar, 2013]. В то же время, если речь идет о непосредственном воздействии на Тreg in vitro , эффекты мелатонина обратные: причем, позитивные обусловлены МТ1/МТ2-опосредованными сигналами, а отрицательные – ROR α .

Таблица 3

Роль эндогенного мелатонина в контроле дифференцировки Treg in vitro в ответ на поликлональную активацию (Mе (LQ; UQ))

Показатель	Небеременные женщины	I триместр беременности	III триместр беременности
Процент	без блокады МТ1/МТ2
CD4+Fox	0.68 (0.56;	0.24 (0.21;	0.45 (0.35;
P3+Т-	1.03)	0.34)*	0.57)#
клеток в 48-часо-	с блокадой МТ1/МТ2
	0.68 (0.53;	0.18 (0.12;	0.34 (0.23;
вой куль-
туре, %	0.97)	0.25)*a	0.42) *#a
Концент-	без блокады МТ1/МТ2
рация	88 589.17	63 569.26	33 671.82
TGFβ в	(43 697.85;	(49 749.59;	(25 813.58;
культура-	135 016.01)	90 124.69)	70 253.28)*
льных	с блокадой МТ1/МТ2
суперна-	69 891.98	71 337.17	27 800.72
тантах,	(41 620.38;	(50 381.87;	(23 103.84;
пг/мл	127 519.07)a	93 557.02)	58 962.70)*#a

Примечания: МТ1/МТ2 – мембранные рецепторы мелатонина, *p<0.05 в сопоставлении с показателем у небеременных женщин, #p<0.05 в сопоставлении с по казателем в I триместре, ^aв сопоставлении с показателем без блокады МТ1/МТ2.

В целом, результаты работы указывают на возможную негативную роль мелатонина в развитии популяции Тreg, которая играет ключевое значения для физиологического течения беременности. Принимая во в нимание , что в настояще е время экзогенный мелатонин рассматривается как перспективный препарат для предупреждения ряда осложнений в развитии беременности, в частности, преэклампсии, важно учитывать иммунорегуляторные эффекты гормона.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16 34-60094 мол_а_дк .