Ограниченный протеолиз как способ снижения аллергенности запасных глобулинов семян

Основную часть пищевых растительных белков представляют собой запасные белки семян. Подавляющее число запасных белков семян входит в состав двух консервативных семейств — 7S (вицилины) и 11S глобулинов (легумины) (1). Их аминокислотные последовательности унаследованы от вицилино- и легуминоподобных белков споровых растений (2). В свою очередь, последние произошли от бактериальных оксалатдекарбоксилаз (3). Все эти белки принадлежат обширному суперсемейству ку-пинов, объединяющему десятки функционально разнообразных семейств белков, в структуре которых присутствует β -баррель из антипараллельных

β -стрендов (4).

Третичная структура субъединиц олигомерных молекул оксалатдекарбоксилаз и запасных глобулинов дополнена группой α -спиралей (2). В субъединицах этих белков присутствуют два домена, каждый из которых образован структурным модулем β -баррель- α -спирали. Двудоменная структура оксалатдекарбоксилаз сформировалась на раннем эволюционном этапе в результате дупликации этого модуля, присутствующего в их однодоменном бактериальном предшественнике (3).

В процессе эволюции в аминокислотных последовательностях запасных глобулинов семян, в целом консервативных, появились протяженные вариабельные гидрофильные вставки, вынесенные на поверхность их олигомерных структур (2, 3). Эти вставки определяют чувствительность нативных молекул запасных глобулинов к быстрому ограниченному протеолизу, с которого и начинается их деградация в прорастающих семенах и in vitro (2). Последующий массированный протеолиз запасных глобулинов происходит по поочередному механизму (5), приводящему к полному разрушению их молекул (3).

В семенах арахиса (6-8), сои (9-11) и многих других культурных растений, используемых в пищевом рационе, — орехов (12-14), миндаля (15) и горчицы (16), запасные 7S и 11S глобулины являются аллергенами. Эта информация, а также ряд дополнительных сведений внесены в базу данных SDAP (Structural database of allergenic proteins) (17). В некоторых из запасных глобулинов — 7S глобулинах арахиса (18) и чечевицы (19), 11S глобулинах арахиса (20), сои (21, 22) и гречихи (23) — идентифицированы антигенные детерминанты (IgE эпитопы), ответственные за IgE связывание. Многие из IgE эпитопов принадлежат областям последовательностей запасных глобулинов с повышенной чувствительностью к протеолитической атаке, что показывает принципиальную возможность снижения аллергенности запасных глобулинов семян посредством их ограниченного протеолиза.

В настоящем обзоре для подтверждения этой гипотезы проанализированы экспериментальные данные, полученные при исследовании ограниченного протеолиза запасных глобулинов семян арахиса ( Arachis hypogaea L.), сои ( Glycine max L.) и некоторых других растений.

Ограниченный протеолиз 11S глобулинов и IgE эпитопы, идентифицированные в их последовательностях. Структура α -цепей субъединицы Ara h3 (pdb|3c3v) 11S глобулина арахиса (24), типичная для 11S глобулинов семян сои (25, 26) и ряда других растений (27, 28), образована β -баррелем из антипараллельных β -стрендов BCDEFGHI, соединенных с группой α -спиралей h1, h2, h3, и дополнена β -стрендами Z, A ′ -A, E ′ -F ′ и J-J ′ , а также α -спиралями h0 и h1 ′ . Три гидрофильные неупорядоченные области в α -цепях 11S глобулинов потенциально чувствительны к ограниченному протеолизу (2): петля между β -стрендами E и F (E ′ -F ′ ), петля между β -баррелем и α -спиралями и С-концевой участок (рис. 1, табл. 1, соответственно области а, б и в).

Для 11S глобулинов характерна следующая последовательность реакций ограниченного протеолиза (2). Процесс начинается с отщепления чувствительной к протеолизу гидрофильной С-концевой области (см. рис. 1, табл. 1, область в). Дальнейшее действие протеиназ приводит к расщеплению петли между β -баррелем и α -спиралями (см. рис. 1, табл. 1, область б). В зависимости от индивидуальных особенностей структуры 11S глобулина и специфичности протеиназы петля между β -стрендами E и F может либо оставаться интактной, либо расщепляться (см. рис. 1, табл. 1, 476

область а). Положение точек расщепления α -цепей 11S глобулинов опре-

Номера аминокислотных остатков

Рис. 1. Третичная структура α -цепи 11S глобулина арахиса ( Arachis hypogaea ) Ara h3 (pdb|3c3v) .

А — ленточная диаграмма. Неупорядоченные области (а, б, в) в α -це-пях 11S глобулинов потенциально чувствительны к ограниченному протеолизу (2). Стрелкой отмечена пептидная связь N325-G326, расщепляющаяся при созревании молекулы Ara h3. Остаток Cys88 участвует в формировании дисульфидной связи между α - и β -цепями. Темные участки диаграммы соответствуют последовательностям IgE эпитопов 1-4.

Б — доступная растворителю площадь аминокислотных остатков ASA (accessibility surface area) в последовательности α -цепи. Приведенные значения ASA (31), выраженные в Å ² , соответствуют средним величинам, рассчитанным для групп из 10 остатков в аминокислотной последовательности α -цепи. График соответствует модельной четвертичной структуре гомогексамера Ara h3, построенной при использовании в качестве шаблона мономера pdb|3c3v (31). Стрелками обозначено положение точек расщепления α -цепи при ограниченном гидролизе трипсином (32). Цифрами показано положение IgE эпитопов 1-4 в аминокислотной последовательности Ara h3.

1. Точки расщепления α -цепей ( ↓ ) при ограниченном протеолизе запасных 11S глобулинов семян сои Glycine max Gly m G1-G5, арахиса Arachis hypogaea Ara h3 и abl14270 (ARAhy), подсолнечника Helianthus an-nuus aaa33374 (HELan), овса Avena sativa aaa32720 (AVEsa), кедра Pinus sibirica caa77569 (PINsi) и тыквы Cucurbita maxima pdb|2e9q (CUCma)

Вторичная структура			Субъединица	Протеиназа
A′A - BCD --- E --- а	FGHIJ h1 h2h3J′
	б	в
	↓	↓	Gly m G1-G5	Папаин (30)
**	** ↓	*       ↓ *	Gly m G2	Трипсин (34)
** ↓	** ↓	*       ↓ *	Gly m G2	Трипсин (32)
	↓	↓	Gly m G5	Папаин (35)
*          ↓	↓	*      ↓ **	Ara h3	Папаин (31)
↓	↓	↓	ARAhy	Трипсин (32)
↓	↓	↓	HELan	Папаин (36)
↓	↓	↓	AVEsa	Папаин (37)
	↓	↓	PINsi	Папаин (38)
	↓	↓	CUCma	Папаин (39)

П р и м е ч а н и е. Разрушающийся при ограниченном протеолизе участок h1h2h3J’ выделен подчеркиванием. Звездочками отмечено положение IgE эпитопов, идентифицированных в субъединицах 11S глобулинов сои Gly m G1 (21) и Gly m G2 (22) и арахиса Ara h3 (20).

делено по результатам N-концевого секвенирования фрагментов (29, 30) или по совокупности косвенных данных (специфичность протеиназы, последовательность формирования фрагментов и их молекулярные массы). О потенциальной чувствительности к ограниченному протеолизу неупорядоченных областей (см. рис. 1, а, б, в) в аминокислотных последовательностях 11S глобулинов свидетельствует их относительно высокая доступность рас- творителю ASA, показанная на примере Ara h3 (см. рис. 1, Б).

Отщепляемый С-концевой участок, охватывающий область α-спиралей h1h2h3 и β-стренда J’ (см. табл. 1), разрушается до коротких пептидов, что характерно не только для Ara h3 (31), но и для других 11S глобулинов (2). Следует отметить, что N-концевая область α-цепи Ara h3, как и всех исследованных 11S глобулинов (2), нечувствительна к протеолитической атаке. Три из четырех IgE эпитопов, идентифицированных в субъединице 11S глобулина арахиса Ara h3 (20) (см. рис. 1, табл. 1), принадлежат к С-концевой области α-цепи, разрушающейся при гидролизе папаином (31). То есть ограниченный протеолиз субъединицы Ara h3 может привести к существенному снижению ее аллергенности.

В состав гетерогексамерной молекулы 11S глобулина арахиса входят девять субъединиц, весьма консервативных в С-концевой области α -цепей, где присутствуют три из четырех IgE эпитопов Ara h3 (см. рис. 1, 2, табл. 1). О потенциальной способности к связыванию IgE каждой из последовательностей других субъединиц 11S глобулина арахиса, гомологичных второму и третьему IgE эпитопам Ara h3, можно судить по результатам определения PD-индексов (property-based peptide similarity index for two sequences) (40). Метод основан на сопоставлении физико-химических свойств каждой из аминокислот последовательности IgE эпитопа, идентифицированного в белковом аллергене, с каждой из аминокислот близкого по первичной структуре участка последовательности исследуемого белка. По мере возрастания различий между сравниваемыми участками этих последовательностей величина PD индексов увеличивается от 0 (последовательности идентичны) до предельной величины, равной 10, выше которой присутствие соответствующего IgE эпитопа маловероятно (40).

Присутствие второго и третьего IgE эпитопов Ara h3 (см. рис. 1, Б) в гомологичных участках последовательностей шести из восьми субъединиц 11S глобулина арахиса, неидентичных Ara h3 (31), весьма вероятно (величина соответствующих PD-индексов не превышает 2,9). Наконец, последовательности четвертого IgE эпитопа Ara h3 (см. рис. 1, Б) и соответствующих предполагаемых IgE эпитопов в двух других субъединицах 11S глобулина арахиса (aag01363 и abf93402) идентичны. То есть ограниченный протеолиз не только субъединицы Ara h3, но и всей гетерогексамерной молекулы 11S глобулина арахиса может сопровождаться существенным снижением его аллергенности.

Рис. 2. Аминокислотные последовательности С-концевой области α -цепей 11S глобулинов арахиса Arachis hypogaea (A1 — pdb|3c3v, A2 — abl14270) и сои Glycine max (G1 — pdb|1fxz; G2 — baa00154) . Цифры слева соответствуют нумерации аминокислотных остатков в полных последовательностях субъединиц. В нижних строчках показаны идентичные аминокислотные остатки (*) и их консервативные (:) и полуконсерва-тивные (.) замещения. Стрелки соответствуют пептидным связям, расщепляемым трипсином ( ↓ ) (29, 32, 34) и папаином ( ↑ ) (30, 32). Жирным шри-

hl'

Al 185 EFLRYQQQSRQSRRRSLPYSPYSPQSQPR^QEEREFSPRGQHSR R A2 185 EFLRYQQQSRQSRRRSLPLSPYSPQ--PG QEDREFSPQGQHGR>Lr G1 172 EFLKYQQ-EQGGHQSQ------------- К

G2 170 EFLKYQQQQQGGSQSQ   hl         h2h3

Al 229 E R AGQEEEHEGGNIFSGFTPEFLAQAFQVDDRQIVQNLRGENESE A2 227 E R AGQEQENEGGNIFSGFTSEFLAQAFQVDDRQIVQNLRGENESE G1 188 gTk hqqeeeneggsilsgftleflehafsvd-kqiaknlqgenege G2 187 g?k-L-qqeeenegsnilsgfapeflkeafgvn-mqivrnlqgeneee

J'

Al 274 eqgaivtvr>Lgglrilspdrk rgadeeeeydedeyeydeedrrrgr A2 272 EQGAIVTVK GGLRILSPDRK SP-DEEEEYDEDEYAEEERQQDRRR G1 232 DKGAIVTVK GGLSVIKPPTD EQQQRPQEEEEEEEDEKPQCKGKDK G2 230 DSGAIVTVK GGLRVTAPAMR>LkPQ---QEEDDDDEEEQPQCVETDK фтом выделены последовательности IgE эпитопов, подчеркиванием — аминокислотные остатки Arg и Lys повышенной доступности растворителю (ASA >100 Е) в модельных олигомерных структурах А1 и G1.

Перспективы снижения аллергенности 11S глобулина сои посредством ограниченного протеолиза не столь однозначны. С одной стороны, ограниченный протеолиз субъединицы Gly m G1 приводит к удалению 478

участка α -спирали h1h2h3- β -стренд J ′ , где присутствуют оба идентифицированных IgE эпитопа (см. табл. 1, рис. 2). Наличие двух соответствующих IgE эпитопов в гомологичных последовательностях субъединиц Gly m G3, Gly m G4 и Gly m G5 не исключено (PD-индексы от 0 до 5,9). С другой стороны, только один из IgE эпитопов, идентифицированных в 11S глобулине сои Gly m G2 (см. табл. 1), может быть удален при его ограниченном протеолизе папаином (см. рис. 2). При этом присутствие соответствующего IgE эпитопа в гомологичных участках последовательностей других субъединиц 11S глобулина сои маловероятно (величина PD-индексов близка к 10).

Ограниченный протеолиз 7S глобулинов и IgE эпитопы, идентифицированные в последовательности 7S глобулина арахиса Ara h1. N- и С-концевые домены субъединиц 7S глобулинов струк- турно эквивалентны α- и β-цепям 11S глобулинов, но отличаются от по- следних по нескольким признакам (41): область междоменного линкера в 7S глобулинах не расщеплена, в их структурах отсутствует междоменная дисульфидная связь. В 7S глобулинах известной третичной структуры из семян канавалии (42), фасоли (43), сои (44), вигны (45, 46) и сосны (47) присутствует ряд неупорядоченных областей, потенциально чувствительных к ограниченному протеолизу (2) (табл. 2, рис. 3).

2. Точки расщепления (↓) N-концевого домена при ограниченном протеолизе запасных 7S глобулинов семян арахиса Arachis hypogaea Ara h1, сои Glycine max Gly m α, Gly m α′, Gly m β и фасоли Phaseolus vulgaris (PHAvu) Вариабельное N-концевое удлинение N-концевого домена (см. табл. 2, область а), характерное для 7S глобу- Вторичная структура ------------Z-A′ABCDEFGHIJ-h1-h2-h3--J′h4-      Субъеди- Протеиназа ница а                           б в ******↓ ↓             * * * ↓* ↓ Ara h1       Папаин (50) ↓                          ↓    Gly m α      In vivo (51) ↓                            ↓                   C2 (52) ↓                        ↓    Gly m α´     Трипсин (32) ↓                            ↓                   C2 (52) ↓    Gly m β      In vivo (51) ↓                 CPPh (53) ↓                Трипсин (54) ↓    PHAvu       In vivo (55) ↓                   CPPh (53, 56, 57) ↓                Трипсин (58) ↓                   C2 (52) ↓                   LLP (56, 57) П р и м е ч а н и е. Звездочками отмечено положение IgE эпитопов, идентифицированных в субъединице арахиса Ara h1 (18). С2 и CPPh — эндогенные папаиноподобные протеиназы из прорастающих семян соответственно сои и фасоли. линов конвицилинового типа, проявляет наибольшую чувствительность к протеолизу (2). Область между α-спи-ралью h3 и β-стрендом J′ (см. табл. 2, область б), неупорядоченная не во всех 7S глобулинах, относительно коротка; сведений об ее чувствительности к протеолизу не имеется. Исключение составляет 7S глобулин арахиса Ara h1, у которого эта область удлинена (48, 49) и расщепляется при гидролизе папаином (см. табл. 2, см. рис. 3, Б). Неупорядоченная область междоменного линкера чувствительна к протеолизу во всех исследованных 7S глобулинах (2) (см. табл. 2, область в). Наконец, известна чувствительность к ограниченному протеолизу удлиненной петли между β-стрендами E и F в С-концевом домене 7S глобулинов (2).

В субъединице 7S глобулина арахиса Ara h1, проявляющей наибольшую аллергенность среди запасных глобулинов семян (59), установлено присутствие 21 IgE эпитопа (18). IgE эпитопы 1-3 принадлежат N-концевой последовательности, удаляемой посттрасляционно (60). IgE эпитопы 4-9 (см. рис. 3, А), локализованные в чувствительной области N-концевого удлинения (см. рис. 3, Б, область а), которое изобилует остатками, соответствующими субстратной специфичности папаина (61), удаляются при начальной атаке этим ферментом (50). Последующее действие папаина приводит к разрушению чувствительной области между α-спиралью h3 и β-стрендом J′ (см. табл. 2, область б), специфично удлиненной в последовательности Ara h1, где локализован IgE эпитоп 13 (см. рис. 3, A).

Рис. 3. Структура N-концевого домена 7S глобулина арахиса Ara h1 (pdb|3smh).

А — ленточная диаграмма третичной структуры. Неупорядоченные области а, б и в показаны штриховыми линиями. Темные участки диаграммы соответствуют последовательностям IgE эпитопов 4-13 в зрелой молекуле Ara h1 (18).

Б — первичная структура. Неупорядоченные области: а — N-концевое удлинение, б — между α -спиралью h3 и β -стрендом J ′ , в — С-концевая область. Стрелки соответствуют пептидным связям, расщепляемым папаином (50). Подчеркиванием выделены аминокислотные остатки с повышенной доступностью для растворителя (ASA > 100 Е), соответствующие субстратной специфичности папаина (61). Эти остатки присутствуют в кристаллической структуре олигомера pdb|3smh, а также его модели (pdb|3s7e в качестве шаблона) (50) в областях б и в. Жирным шрифтом показаны последовательности IgE эпитопов 10-13.

Следует отметить относительно высокую доступность для растворителя у участка α -спиралей h1-h3, — в 3,5 раза выше, чем ASA у остальной части N-концевого домена Ara h1. Поэтому заманчиво попытаться подобрать условия ограниченного протеолиза, обеспечивающие разрушение этого потенциально чувствительного участка α -спиралей, где присутствуют IgE эпитопы 11 и 12 (см. рис. 3, А).

Субъединицы 7S глобулина арахиса в составе его гетеротримерной молекулы чрезвычайно консервативны. Весьма вероятно, что IgE эпитопы, идентифицированные в Ara h1, присутствуют и в других субъединицах этого белка: соответствующие PD-индексы не превышают 2,5. Ограниченный протеолиз папаином приводит к существенному снижению аллергенности всей гетероолигомерной молекулы 7S глобулина арахиса в связи с удалением более чем третьей части IgE эпитопов.

Таким образом, приведенные в настоящем обзоре результаты исследований ограниченного протеолиза 11S и 7S глобулинов арахиса, сои и некоторых других растений свидетельствуют о перспективности использования этого метода для существенного снижения аллергенности запасных глобулинов семян.