Онколитические вирусы в онкологии

Л.Н. Уразова, Т.И. Кузнецова

НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

В 90-х годах возобновились исследования по проверке уже неоднократно выдвигавшейся гипотезы о целесообразности использования вирусов в терапии злокачественных опухолей [52, 54]. Естественные аттенуированные штаммы вирусов (везикулярного стоматита, реовирусов), а также генетически модифицированные (простого герпеса типа I, аденовирусов) обладают повышенной эффективностью инфицирования и репликации в опухолевых клетках. Однако их специфичность и терапевтический потенциал в отношении этих клеток недостаточно из у чены.

Такие проявления вирусной инфекции, как цитолитическая активность, молекулярные проявления на клеточном уровне, индукция новых или модификация существующих антигенов опухолевой клетки, вирусный иммуногенез, репродукция вирусов путем почкования (перенос опухолевого антигена), интерфероногенез, позволяют рассматривать применение виротерапии как перспективный подход к иммунотерапевтическому воздействию на опухолевый рост.

Виротерапия опухолей

Клинические наблюдения тропизма энтеровирусов к опухолям человека на больных IV стадии заболевания [6, 9] показали, что отобранные модели клинически безвредны и эпидемиологически безопасны. Они способны, проникая в опухолевые клетки, не только синтезировать свой антиген, но и репродуцировать инфекционную форму вируса. Определенное количество инфицированных опухолевых клеток погибает с характерным для энтеровирусов цитопатическим эффектом, однако терапевтическое действие этих препаратов у больных IV стадии заболевания неэффективно. Это связано, по мнению авторов, с ничтожной в сравнении с массой опухоли литической активностью вируса при одновременном развитии противовирусного иммунитета, прекращающего этот процесс. Согласно полученным данным, у больных в сыворотке крови уже к концу первой недели после введения вируса появляются специфические антитела к нему.

Опираясь на эти результаты, А.Я. Муцениеце, Я.В. Бумбиерис [7] и А.К. Фердат, Р.Ж. Брувере [11] предполагают, что в клинической практике терапия вирусами может применяться только после радикальных операций с целью уничтожения остаточных опухолевых клеток, метастазов, стимуляции противоопухолевого иммунитета, а также по показаниям интерферонотерапии.

В качестве онкотерапевтических агентов предлагаются в основном аттенуированные штаммы природных вирусов: гриппа [37], болезни Ньюкастла [16, 51, 64], герпеса [30, 52, 66], аденовирусов [21, 36, 46], а также различные рекомбинантные вирусы, полученные из природных путем генно-инженерных манипуляций [39, 40, 54, 61, 72, 73]. Отмечены онколитические эффекты вирусов паротита, Сендай, Семлики, Синдбис, но мало известно о механизмах их противоопухолевой активности [13, 71]. Показано, что онколитическим действием обладает и вирус кори, в частности, инфицирование этим вирусом связывают с регрессией лимфомы Беркитта [21, 32].

Противоопухолевая вакцинация

Вакцинотерапия - метод, основанный на использовании любого антигена или комплекса антигенов (совместно или без адъговантов) для модуляции иммунного ответа [60]. Вакцинотерапия относится к методам активной специфической иммунотерапии. У онкологических больных она применяется для стимуляции иммунного ответа пациента на собственную опухоль и может использоваться как с адъювантной (после хирургического вмешательства при отсутствии отдаленных метастазов), так и с лечебной целью (при диссеминированных опухолях).

При злокачественном росте в организме хозяина не развивается полноценный иммунный ответ на опухоль. Главной причиной этого феномена, по современным представлениям, является недостаточная иммуногенность опухоли. Считается, что опухолевые клетки возникают в организме достаточно часто и если они иммуногенны, то легко элиминируются иммунной системой. Опухолям, достигающим клинических размеров, удаётся ускользнуть от иммунного надзора, как правило, вследствие малой иммуногенности составляющих их клеток.

Экспериментальные работы на инбредных животных показали существование в злокачественных опухолях высокоспецифических антигенов, способных обеспечить развитие адекватного иммунного ответа. В опухолях человека такие антигены, часть из которых экспрессируется почти 90% опухолей, выявлены только в последнее время (GD3 в клетках меланомы, А-33 - колоректального рака, G250 - рака почки). Эти антигены получили название «опухолеассоциированных», так как почти не определяются в нормальных клетках. Проводятся многочисленные исследования по применению вакцин, основанных на использовании этих антигенов, в терапии ряда солидных опухолей: меланомы - MAGE-1, MAGE-3, MAR.T-1, gplOO, gp75, тирозиназа; рака предстательной железы — простатспецифический антиген (PSA), несколько серотипов вируса папилломы человека; рака молочной железы - Р53, MUC-1, HER-2-neu [3, 4].

При этом применяются как чистые, так и неочищенные вакцины, а также препараты из полных опухолевых клеток и из белков, извлеченных из опухоли [60]. Кроме того, в зависимости от источника антигена- используют аутологичные (из опухолевых клеток больного), аллогенные (из клеточных линий опухолей других больных), рекомбинантные или синтетические вакцины [3, 4]. Для повышения эффективности вакцин применяются дополнительные методы стимуляции специфического Т-клеточного ответа, позволяющие обеспечить создание местных и системных условий для распознавания опухолеассоциированных антигенов «профессиональными» анти-генпрезерггирующими клетками.

При изучении свойств онкотропных вирусов оказалась возможной опухолеспецифическая иммунизация интактных животных препаратами опухолевых клеток, инфицированных вирусами и подвергнутых разрушению, или их фракциями [15, 19, 28, 69]. Иммуногенными свойствами обладали естественный материал вирусного онколиза [48-50], живые вирусинфицированные клетки и их лизаты [43], гомогенаты опухолевых клеток, зараженные вирусами вне организма [15, 22, 69]. Усиление иммуногенных свойств опухолевых клеток наблюдалось при различных формах вирусной инфекции, от литической до персистентной, вызванных представителями различных таксономических групп вирусов [10,12, 29, 43].

Наиболее часто для усиления иммуногенных свойств опухолевых клеток и приготовления онколизатов использовались вирусы, созревающие на клеточных мембранах путем почкования (мик-со-, ретровирусы и др.) и включающие в оболочку антигены опухолевой клетки, в том числе и опухолеассоциированные [10, 12, 48]. Из других семейств интерес представляли поксвирусы, в частности вирус осповакцины, индуцирующие глубокую перестройку антигенного потенциала опухолевой клетки и представляющие сложную ан- тигенную структуру [1, 5]. Эффективность онколизатов была показана при их применении как в моновариантном, так и в сочетании с химиотерапией цитостатиками или интерлейкинами при лечении экспериментальных опухолей [17, 18]. В клинической практике онколизаты применяются после хирургического вмешательства для профилактики рецидивов и метастазов, в основном пока для терапии меланомы кожи и рака прямой кишки [20, 47]. Способ их использования различен -от еженедельного введения в течение 2-3 мес до ежемесячного на протяжении года и более после удаления первичного опухолевого очага. Дозы однократно вводимого онколизата, по литературным данным, варьируют от 0,005 до 2 мг опухолевого материала или (1-10)Х106клеток [47, 70].

В целом согласно экспериментальным протоколам применение терапии онколизатами на 15—30% эффективнее, чем стандартное химиотерапевтическое воздействие. Активно ингибируется метастазирование, отмечены отдельные случаи полной регрессии опухолей, повышается противоопухолевый иммунный ответ [45, 70]. Однако применение онколизатов ограничено сроками развития рака, так как трудно ожидать эффекта иммунизации у больных с далеко зашедшим опухолевым процессом, когда организм насыщен опухолеассоциированными антигенами, а противоопухолевые реакции иммунитета блокированы [7, 8].

Разрабатываются методы, которые позволяют получить клетки-носители онколитических вирусов, доставляющие их в опухоль. Клетки терато-карциномы человека поддерживают репликацию вируса простого герпеса-I до 200 ЕД, а при облучении — до 70 ЕД [25]. При введении инфицированных облученных клеток PAS в перитонеальную полость мышей с заболеванием яичников вирус локализовался в опухолевых клетках, а не в нормальном мезотелии. При этом доставка онколитических вирусов на клеточных носителях ассоциируется с повышением противоопухолевого эффекта [25].

Генотерапия злокачественных опухолей

Генотерапия рака представляет собой комплекс лечебных мероприятий по переносу генетического материала в организм больного с целью коррекции зародышевых мутаций в геноме.

На самом деле, большая часть генетических исследований сфокусирована не столько на исправлении самого генома, сколько на компенсации последствий, вызванных соматическими или зародышевыми мутациями, что связано с техническими ограничениями, присущими генной инженерии сегодня.

Под термином «генотерапия рака» чаще всего подразумевается экстракорпоральная трансфекция в опухолевые или иммунокомпетентные клетки генов, кодирующих синтез цитокинов (интерлейкинов-1, -2, -4, -6, -12; фактора некроза опухолей или их комбинации), белков комплекса гистосовместимости. В качестве переносчиков генов используются векторы на основе вакцинных вирусов, важным свойством которых является тропность к клеткам-реципиентам: ретровирусов [30], поксвирусов [23], аденовирусов [68], вирусов гриппа [44] и болезни Ньюкастла [51], а также рекомбинантных штаммов [62, 67]. Проникая в клетки, такие векторы провоцируют синтез большого количества клеточного медиатора, в той или иной степени необходимого для роста и/или стимуляции цитотоксических свойств иммунокомпетентных клеток [24], или индуцируют образование полноценных поверхностных опухолевых маркеров, что повышает иммуногенный потенциал опухолевых клеток [65]. Наличие высокой концентрации цитокина и полноценных антигенов на поверхности опухолевых клеток создает эффективный иммунный конфликт, приводящий в конечном итоге к иммунному отторжению опухолевой ткани. Кроме того, при использовании в качестве вектора-переносчика он-котропных вирусов запускается ряд противоопухолевых механизмов, на которых' основан феномен онкотропизма [7, 8, 70].

Поскольку экспрессия рецептора аденовирусов и Коксаки (CAR) обратно пропорциональна малигнизации, она сведена до минимума в инфицированных опухолевых клетках и повышена в нормальных [36, 46]. Чтобы избежать этой проблемы, созданы биспецифические антитела против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), экспрессия которого в опухолевых клетках достаточно высока. Эти антитела предотвращают инфицирование нормальных клеток, экспрессирующих CAR [25]. Однако этот подход не дал результатов в отношении других ДНК-содержащих вирусов, например вируса простого герпеса I типа. Это может объясняться сложностью взаимодействия данных типов вирусов с клеткой-хозяином. HSV-I-инфекция вовлекает в этот процесс несколько гликопротеинов, взаимодействующих с различными рецепторами, поэтому вторичное инфицирование практически невозможно [30, 63, 66]. В настоящее время ведется разработка онколитических вирусов, которые смогут специфически связываться с другими типами опухолеспецифических поверхностных белков клеток.

Аденовирусный белок ElB55kD блокирует активность гена-супрессора р53, что препятствует апоптозу и позволяет произойти репликации аденовируса [73]. Мутантный штамм аденовируса, дефектный по этому белку и известный как ONXY-015, что было показано в ряде исследований, селективно реплицируется и лизирует опухолевые клетки, несущие мутации р53 или имеющие другие дефекты в функции этого гена [55, 56, 61, 72]. Более того, установлено, что эти мутации могут поражать несколько клеточных функций, приводя к недостаточной репликации даже опухолевых клеток [34]. Хотя делеция аденовирусного белка Е1В55Ю обеспечивает вирус некоторой опухолевой селективностью, при этом поражаются и другие фазы жизненного цикла вируса, что уменьшает эффективность вирусной репликации и онкологической активности и ставит под сомнение специфическую избирательность вируса [28, 31, 33, 34, 59]. Есть сведения, что онколитический аденовирус 01/РЕМЕ также обладает повышенной селективностью в отношении клеток с дефектным геном р53 [59].

Завершились успехом первые клинические испытания генно-инженерных методов повышения иммуногенности неоплазм. Так, в одном из экспериментов в опухолевые клетки трансфеци-ровались гены комплекса гистосовместимости HLA. Злокачественные клетки продуцировали опухолеспецифические антигены, утраченные в процессе малигнизации, что активировало противоопухолевый иммунитет. При этом защитная реакция организма осуществлялась не только против модифицированных, но и против исходных клеток опухоли [14, 65].

Другие генотерапевтические схемы включали пересадку в трансформированные клетки пациентов генов факторов роста лимфоцитов — интерлейкинов-2, -4 и других, что приводило к их суперпродукции частью опухолевых клеток и привлекало в очаг новообразования лимфоциты [38]. Противоопухолевый ответ становился более эффективным. Однако такой подход ограничивается тем, что далеко не все формы злокачественных новообразований чувствительны к цитотоксическому действию инфицирующих опухоль лимфоцитов [14, 27].

При введении больным опухолями головы и шеи, яичников, головного мозга, предстательной железы штамма онколитического аденовируса ONYX-015 показано минимальное или полное отсутствие токсических эффектов [42], Кроме того, установлено, что при введении этого вируса в опухоль в комплексе с 5-фторурацилом либо цисплатином более чем у 50% больных в течение 6 мес наблюдалась полная или частичная регрессия опухоли [41]. Полученные клинические данные, несмотря на относительно ослабленный онколитический потенциал, показанный этим вирусом, дают гарантию того, что при сочетанном применении с цитостатиками терапевтический эффект может быть усилен [35, 59]. Оригинальные терапевтические подходы позволяют значительно увеличить толерантность больного к цитостатической химиотерапии, так как наиболее выраженным побочным эффектом цитостатиков является поражение костного мозга.

Мутантный штамм аденовируса, при котором промотор простатспецифического антигена контролирует экспрессию гена Е1А, в количестве 20-80 инфекционных доз вводился в опухоль больных местнораспространенным раком предстательной железы [26]. Через 7 сут после начала терапии уровень PSA,< по которому можно судить о терапевтической активности препарата, снижался на 30-50%. У больных, у которых до лечения отсутствовали либо содержались в минимальном титре антитела к аденовирусам, отмечен первый пик вирусной ДНК уже через 30 мин после инъекции. Второй пик ДНК определялся на протяжении 2—8 сут после инфицирования, значительно превышая исходный уровень.

Введение в опухоль больных рецидивирующей злокачественной глиомой мутантных штаммов G-207 и 1717 вируса простого герпеса (до ЗхЮ9 инфекционных доз), в отличие от дикого типа, который вызывал энцефалит, оказалось эпидемиологически безопасным и хорошо переносилось больными [53, 57, 58]. Анализ опухоле- вых эксплантатов на 4—9-й день после инъекции выявил интенсивную репликацию вирусов, в несколько раз превосходящую по величине его исходный уровень.

Таким образом, прогресс новых научных направлений биологии, генетики и генной инженерии позволил разработать новые подходы к терапии злокачественных новообразований. Хотя в последние десятилетия появились определенные достижения в лечении онкологических заболеваний, однако возможности дальнейшего совершенствования классических методов терапии неоплазий практически исчерпаны, что обусловлено как их побочными эффектами на организм больного, так и низкой эффективностью в плане предупреждения прогрессирования заболевания.

Четкое понимание роли онкогенов и их продуктов в злокачественной трансформации клеток, молекулярных механизмов регуляции их генома, биологической природы лекарственной резистентности и механизмов, лежащих в основе несостоятельности противоопухолевого иммунитета, — все это является своего рода материальной базой для внедрения в онкологическую практику воздействий, способных усиливать эндогенные механизмы антибластомной защиты организма. Высокоперспективным в этом плане является использование разнообразных модификаторов биологических реакций, в том числе тех, структура которых соответствует белково-нуклеотидной природе живого организма. В частности, открыта новая грань биологических возможностей вирусов, которые всегда рассматривались только как болезнетворные агенты, а именно их векторные, иммуномодулирующие и противоопухолевые функции. Целесообразность использования вирусных агентов в комбинированной терапии рака обусловлена их способностью, помимо прямого цитодеструктивного действия, влиять как на чувствительность опухолевых клеток к терапевтическим воздействиям и эндогенным противоопухолевым механизмам, так и на организм в целом, восстанавливая его естественные антиканцерогенные свойства.

Однако использование онкотропных вирусов как терапевтических агентов в онкологической клинике вызывает определенные сомнения у ряда исследователей, поскольку события, происходящие в организме на уровне генов, пока недостаточно изучены и представляются явлениями дос- таточно сложными. Жизнедеятельность объектов вирусной природы предполагает различные манипуляции с ДНК пермиссивных клеток. Хотя прогресс в изучении этой стороны взаимодействия вирус-клетка очевиден, но из-за наличия «белых пятен», присущих и нашим знаниям о взаимоотношениях других объектов живой природы, в частности прокариотов и эукариотов, такого рода приложение вирусной активности вызывает вполне обоснованную настороженность относи- | тельно перспектив ее практической реализации. Тем не менее при клиническом применении всех доступных ныне противоопухолевых методов и средств часто приходится делать выбор между очевидным антибластомным действием препарата и вызываемыми им побочными эффектами, предотвратить или хотя бы смягчить которые обычно представляется достаточно сложным.

В настоящее время учеными США и других зарубежных стран проведены первые клинические испытания методов генотерапии и противоопухолевой вакцинации, в основе которой, как упоминалось ранее, лежит использование феномена вирусного онкотропизма, при этом получены достаточно обнадеживающие результаты. Онкологи высказываются в пользу такой терапии, пока, однако, достаточно дорогостоящей. Основной аргумент такой позиции: долгое балансирование между выбором эффективного метода терапии погибающих от рака пациентов и непредсказуемыми ее последствиями приводит в конечном итоге к печальному результату.

Помимо проблемы возможных негативных последствий терапии рака онкотропными вирусами и их производными, перед исследователями стоит вопрос относительно ее временной протяженности для каждого конкретного вируса. Это связано с тем, что, как известно, при приникно-вении в организм чужеродного агента, в частности вируса, происходит активация иммунной системы — вырабатываются антитела к соответствующим антигенам, мобилизуются макрофаги и механизмы клеточного иммунитета. Однако ряд исследователей не без основания полагают, что наличие иммунитета к какому-либо инфекционному агенту не является препятствием к использованию его аттенуированного аналога для приготовления противоопухолевых вакцин (онколизатов). Подтверждением этой точки зрения служит успешное использование в качестве терапев- тических агентов в условиях онкологической клиники штаммов вирусов полиомиелита, Нью-кастла, осповакцины, аденовирусов. Но вопрос о том, сохраняются ли при этом полноценные противоопухолевые свойства самих вирусов, требует дальнейшего экспериментального изучения.

Тем не менее очевидна насущная потребность в принципиально новых подходах к лечению рака, которые реально предлагает биотерапия, поэтому исследование как фундаментальных, так и прикладных вопросов, связанных с противоопухолевой активностью вирусов как одного из возможных путей борьбы с онкологическими заболеваниями, достаточно актуально.