Определение аллиина в надземной части лука медвежьего (Allium ursinum L.) методом капиллярного электрофореза

его в культуру и использовании исключительно надземной части растения является актуальным для многих регионов России.

Известно, что сырье лука медвежьего содержит фитонциды, эфирное масло, инулин, флавоноиды, аскорбиновую кислоту, микроэлементы, среди которых йод, германий и селен. По данным зарубежных исследователей, особое внимание уделяется изучению серосодержащих соединений, отвечающих за большинство лечебных эффектов растений рода Allium , основным среди которых является аллиин (более 1,0%), вызывающий регрессии опухолей до полного исчезновения или торможения их роста при инъекциях крысам [5]. Аллиин –(S-Allyl-L-cysteinesulfoxide);3-((S)- Allylsulfiniyl)-L-alanine; (R)-2 fmino-3-(prop-2-tnt-1sulfinyl)-propionicacid) – серосодержащая аминокислота, способная под влиянием фермента аллииназы расщепляться до аллицина, обуславливающего чесночный запах черемши. Однако в литературе нет данных о количественном содержании ни суммы серосодержащих соединений, ни аллиина в надземной части лука медвежьего, произрастающего на территории Северного Кавказа и Краснодарского края.

Цель работы: разработка методики качественного и количественного содержания ал-лиина в надземной части лука медвежьего методом капиллярного электрофореза [1, 3].

Материалы и методы. Исследовали образцы высушенной надземной части лука медвежьего с применением метода капиллярного электрофореза. Образцы сырья были собраны на Северном Кавказе и в Краснодарском крае в 2011-2012 гг. С целью получения оптимальных условий экстракции аллиина из исследуемого сырья, определяли его влажность, изучали влияние температуры, экстрагента, времени экстракции, степени измельчения сырья, вида экстракции, соотношение сырья и экстрагента. Измельченное сырье заливали экстрагентом, настаивали, затем экстрагировали на аппарате для встряхивания. Качественное и количественное определение аллиина в извлечениях проводили методом капиллярного электрофореза, используя систему капиллярного электрофореза Капель 105 (группа компаний «Люмэкс», Россия). В работе использовались кварцевый термостатируемый капилляр с диаметром 50 мкм, общей длиной 75 см и рабочей длиной 65 см. Электролит: раствор натрия тетраборатадекагидрата (0,02 М) с добавкой β-циклодекстрина (0,0044 М) [2]. Для подготовки капилляра и восстановления его поверхности проводили его последовательную промывку водой, 0,5 М раствором хлористоводородной кислотой, водой, 0,5 М раствором натрия гидроксида, водой и затем ведущим электролитом. Аллиин не имеет селективного поглощения в УФ-области спектра, поэтому его определение проводили при 200 нм в катодной области капилляра. Анализ проводили при 20 кВ и температуре 500С. Ввод пробы осуществляли гидродинамически в режиме 150 мБар×с. Все растворы перед вводом центрифугировались при 7000 мин-1 в течение 5 мин. Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям специфичность, линейность, прецизионность и правильность [4]. В качестве стандартного образца использовали аллиина фирмы SigmaAldrich (с чистотой не менее 99%). Раствор стандартного образцаготовили в спирте этиловом 40%.

Результаты и их обсуждение. Результаты анализа раствора стандартного образца аллиина и извлечения из исследуемого сырья представлены на рис. 1 и 2. Из полученных данных следует, что пик аллиина полностью разделен с сопутствующими компонентами сырья (разрешение с ближайшим пиком составляет 1,4), что позволяет использовать выбранные условия для дальнейших исследований.

Следующим этапом работы стало определение основных валидационных характеристик разработанной методики. Ввиду невозможности воспроизведения точного качественного и количественного состава изучаемого объекта, параметр «Специфичность» определяли путем сопоставления времен миграции пика аллиина на электрофореграмме раствора стандартного и испытуемого образца. Кроме того, использовалась добавка стандартного образца к испытуемому объекту. В результате было установлено, что пик аллиина увеличивается пропорционально количеству добавленного стандарта, при этом асимметрия (0,80) и эффективность (порядка 170 000 т.т.) остаются без изменений. Также следует отметить, что разрешение пика аллиина с ближайшим сопутствующим пиком на электрофореграмме составило 1,2, что свидетельствует о приемлемом разделении компонентов пробы. Полученные данные позволяют считать разработанную методику качественного и количественного анализа аллиина специфичной.

Рис. 1. Электрофореграмма раствора стандартного образца аллиина

Рис. 2. Электрофореграмма водного извлечения из лука медвежьего

Параметр «Линейность» определяли путем построения градуировочного графика и расчета коэффициента корреляции (r); «Прецизионность» - путем расчета стандартного (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD); для оценки показателя «Правильность» использовали расчет открываемости (R). Результаты исследования данных валидационных характеристик приведены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют о приемлемых значениях основных валидационных характеристик разработанной методики, что позволяет использовать ее для оценки количественного содержания ал-лиина в сырье.

Таблица 1. Параметры валидационной оценки методики количественного определения аллиина

Далее следовало оптимизировать условия экстракции аллиина, используя разработанную методику. В результате установлено, что максимальное количество аллиина извлекается при использовании в качестве экстрагента воды. При этом достаточно было проводить двукратную экстракцию при комнатной температуре (200С) в течение 30 минут при использовании соотношения сырье - экстрагент 1:20. Размер частиц сырья 2 ммпозволял добиться максимального выхода анализируемого вещества.

Следующим этапом явилось определение аллиина в образца лука медвежьего различных мест сбора. Полученные результаты представлены в таблице 2. Содержание аллиина в испытуемых образах составило от 0,86% до 1,50%

Таблица 2. Содержание аллиина в различных образцах лука медвежьего

Выводы: разработана методика идентификации и количественного определения аллии-на в высушенной надземной части лука медвежьего методом капиллярного электрофореза. Установлены оптимальные параметры его экстракции из сырья. Установлено содержание ал-лиина в образцах черемши различного географического происхождения о 0,87% до 1,50% в пересчете на массу сухого сырья.