Определение фенолкарбоновых кислот в сборе «Панкреофит»

Для лечения и профилактики различных заболеваний наряду с базисной терапией широко используются лекарственные средства растительного происхождения в качестве средств дополнительной терапии в период обострения заболевания, а также в качестве профилактических средств на начальных стадиях заболевания и на этапе противорецидивной терапии [6]. Средства на основе растений влияют на организм человека как корригирующая система благодаря гармоничному сочетанию содержащихся биологически активных веществ, они малотоксичны, обладают мягким и разноплановым дей- ствием, при этом есть возможность рационального сочетания их между собой, что существенно расширяет их терапевтические возможности [3].

Нами разработано растительное многокомпонентное средство, обладающее антиоксидантной и панкреозащитным действием [4, 5].

Действие растительных средств обусловлено присутствием в них биологически активных веществ: полифенолов, полисахаридов, минеральных веществ, аминокислот, органических кислот, витаминов и других, которые обеспечива- ют широкий спектр фармакологического действия фитопрепаратов.

Целью работы является определение содержания фенолкарбоновых кислот в сборе «Пан-креофит» и подбор оптимальных параметров ВЭЖХ, обеспечивающих максимальное разделение фенолкарбоновых кислот.

ВЭЖХ-анализ проводили на приборе PlatinBlue ( Knauer ). При выборе режима элюирования смеси фенолкарбоновых кислот (тип хроматографической колонки, состав подвижной фазы, длины волн детектирования) основывались на строении фенолкарбоновых кислот. Структура исследуемых соединений, содержащих хромофорные группы и обладающих достаточной гидрофобностью, позволила сделать вывод о возможности проведения анализа в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием и использования хорошо изученного элюента – смеси ацетонитрила с водным раствором трифторуксусной кислоты.

При подборе параметров ВЭЖХ, обеспечивающих максимальное разделение фенолкарбоновых кислот, изначально готовили серию растворов кислот (галловой, протокатеховой, окси-бензойной, ванилиновой, сиреневой, кофейной, вератровой, кумаровой, синаповой, анисовой, коричной) 1 мкг вещества в 1 мл ацетонитрила с добавлением 0,05%-ного раствора трифторуксусной кислоты и хроматографировали отдельно для установления времени удерживания кислот. Далее хроматографировали смесь кислот, добиваясь их лучшего разделения на хроматограмме.

Подобраны следующие параметры, обеспечивающие максимальное разделение фенолкарбоновых кислот: колонка Диасфер С10-СN, 5 мкм, 2х120 мм ( БиоХимМак СТ ), подвижная фаза – смесь ацетонитрила и 0,05%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты, элюирование – градиентное (от 6 до 12% АСN за 13 мин, далее до 24% АСN за 9 мин), объем вводимой пробы 5 мкл, скорость потока 0,3 мл/мин, детектирование при 260 и 315 нм.

На рис. 1 приведена хроматограмма модельной смеси фенолкарбоновых кислот, наличие которых предполагалось в исследуемом экстракте.

Можно видеть, что кислоты разделяются достаточно хорошо, а при использовании детектора с диодной матрицей, позволяющего визуализировать спектры элюируемых соединений, становится возможным контролировать присутствие и оценивать содержание фенолкарбоновых кислот в экстрактах.

Согласно данным Н.А. Верниковской [2], экстракцию выполняли водой, в качестве экстрагента использовали 10%-ный водный раствор изопропилового спирта, обладающий хорошей экстрагирующей способностью [1].

Методика приготовления водного извлечения: около 0,2000 г (точная навеска) измельченного сбора (степень измельчения = 1 мм) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 25 мл воды очищенной, закрывают притертой пробкой, помещают на 30 мин в ультразвуковую баню (t=60 °C), затем охлаждают и проводят через бумажный фильтр.

Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси фенолкарбоновых кислот

И.Г. Николаева и др. Определение фенолкарбоновых кислот в сборе «Панкреофит»

Методика приготовления 10%-ного изопро-панольного извлечения: около 0,2500 г (точная навеска) измельченного сырья (степень измельчения = 1 мм) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 20 мл 10%-ного изопропанола, закрывают притертой пробкой, оставляют на 2 суток при комнатной температуре экстрагироваться, проводят через бумажный фильтр.

Получены результаты количественного определения содержания фенолкарбоновых кислот в извлечениях сбора (водное и 10%-ное изопро-панольное) (табл. 2).

В результате проведенных исследований подобраны параметры ВЭЖХ, обеспечивающие максимальное разделение фенолкарбоновых ки- слот: колонка Диасфер С10-СN, 5 мкм, 2х120 мм (БиоХимМак СТ), подвижная фаза – смесь ацетонитрила и 0,05%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты, элюирование – градиентное (от 6 до 12% АСN за 13 мин, далее до 24% АСN за 9 мин), объем вводимой пробы 5 мкл, скорость потока 0,3 мл/мин, детектирование при 260 и 315нм. Идентифицировано только четыре фенолкарбоновой кислоты, выход кислот повышается при использовании в качестве экстрагента 10%-ного изопропилового спирта и составляет 2,09 мкг/мл галловой, 1,90 мкг/мл протокате-ховой, 4,90 мкг/мл кофейной, 0,37 мкг/мл кума-ровой кислот в извлечениях сбора «Панкрео-фит».

Таблица 2

Количественное содержание фенолкарбоновых кислот в сборе «Панкреофит»