Определение индикаторных микроорганизмов для мониторинга инфекционных заболеваний рыб на примере Perca fluviatilis (озеро Арахлей, Забайкальский край)

Характеристика конкретной экологической ситуации. Озеро Арахлей располагается на юге Витимского плоскогорья и принадлежит бассейну оз. Байкал. По уровню продукции органического вещества относится к мезотрофным водоемам [3]. В период с начала 90-х гг. в озере отмечены следующие изменения: значительное сокращение общей площади распространения водной растительности, ограничивающейся глубинами распространения нителлы до 6,0 м [1]; смена у юго-восточного берега формации мхов на чистую формацию зеленой нитчатой водоросли Cladophora aegagropila [9, 13]. Существенные изменения произошли и в зообентоцено-зах: сокращение зоны обитания фитофильных беспозвоночных и увеличение пелофильных [8, 11, 12]. Изменения структуры биоценозов озера Арахлей необходимо рассматривать в комплексе показателей, одним из которых является эвтро-фирование, вызванное природными и антропогенными факторами.

В арахлейской популяции окуня Perca fluviatilis в 2008 г. наблюдалась максимальная биомасса за последние 20 лет [14], а уже в 2009 г. отмечена вспышка аэромоноза окуня [15]. Региональной Госветслужбой Забайкальского края проведены соответствующие экспертизы рыб с подозрением на аэромоноз (ГУ «Забайкальская краевая ветеринарная лаборатория» экспертизы от 07.04.2009 № 6897/329-334, от 23.04.2009 № 16992/380-386, от 25.03.2009 г. № 115 ФГУЗ «Читинская противочумная станция»).

Сведения о бактериальных инфекциях окуня ограничены, хотя ранее сообщалось о различных микроорганизмах, ассоциированных с этим видом [32, 38 и др.]. В целом инфекционные болезни рыб в естественных условиях регистрируются относительно редко, возможно, по причине быстрой гибели и природной утилизации больных особей [5]. Наиболее часто возбудителями инфекций являются патогенные штаммы бактерий, относящиеся к родам Aeromonas, Cytophaga, Pseudomonas, Vibrio и др. [4]. При этом один и тот же возбудитель может вызывать отличающиеся друг от друга патологические изменения у разных видов рыб и при разных условиях. Для некоторых изолированных штаммов отмечена избирательная патогенность по отношению к определенным видам рыб [33]. Каждый из штаммов может являться причиной заболевания самостоятельно, в ассоциациях друг с другом или другими микроорганизмами [5]. В свою очередь бактерии родов Aeromonas и Pseudomonas способствуют возникновению сходных клинических признаков заболеваний у многих видов рыб.

Ввиду комплексной этиологии инфекционных поражений внешних покровов рыб проведение идентификации микроорганизмов связано с рядом трудностей: 1) возбудители инфекций часто относятся к нормальной микрофлоре водных сообществ и патогенные виды могут успешно «маскироваться» сапрофитными формами этого же или близкого по физиологобиохимическим свойствам рода; 2) для отдельных патогенных микроорганизмов доказана способность переходить в некультивируемое, но жизнеспособное состояние, при этом клетки сохраняют вирулентность; 3) для культивирования некоторых бактерий требуется значительное время. Определение и идентификация таких микроорганизмов возможно только молекулярно-генетическими методами на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В последнее время показано, что метод является более чувствительным и эффективным, причем использование мультиплексных ПЦР позволяет одновременно детектировать несколько целевых агентов [20, 32, 37]. Прямой анализ маркерных фрагментов геномов позволяет избегать проблем культивирования и неспецифической детекции, а также корректно и быстро выявлять целевые группы микроорганизмов в пробах биологического материала.

Микроорганизмы, вызывающие язвенные поражения внешних покровов рыб, являются широко распространенными и присутствуют в воде в обычном природном окружении. В нормальных условиях водные животные обладают достаточной устойчивостью к заболеваниям. При изменении экологической ситуации в водоемах возникает риск развития бактериальных инфекций гидробионтов, поэтому определение ключевых индикаторных видов региональных патогенных агентов и разработка современных методов проведения их мониторинга является актуальной и важной научной задачей.

Цели настоящего исследования – молекулярно-генетическая идентификация микроорганизмов, вызвавших эпизоотию в популяции окуня озера Арахлей и определение ключевых индикаторных видов микроорганизмов для мониторинга состояния среды обитания гидробионтов.

Материалы и методы. В августе 2009 г. из озера Арахлей взяты 10 экз. окуня с язвенными проявлениями на внешних покровах. Рыб отлавливали жаберными сетями (ячея 12-70 мм). Соскобы с внешних покровов рыб фиксировали лизирующим раствором (наборы РИБО-сорб, ДНК-сорб, «АмплиСенс», Москва), проводили выделение ДНК по модифицированной методике, ПЦР – на консервативных бактериальных праймерах [2]. Для лигирования брали суммарные ампликоны и использовали набор GeneJETTM PCR Cloning Kit (Fermentas) и CaCl2-компетентные клетки Escherichia coli (штамм XL-1) [36]. Анализировали все выросшие колонии. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на приборе ABI 3130xl (Genetic Analyzer, США) в Межинститутском центре секвенирования ДНК (г. Новосибирск). Для сравнительного и филогенетического анализа данных, полученных нами и зарегистрированных в международной базе EMBL банка, использовали пакеты программ FASTA , ClustalW и Mega v3.1.

Результаты и обсуждение. Доля рыб с язвенными поражениями в августе 2009 г. составляла около 50% от общего улова окуня. У рыб наблюдались кровоточащие язвы диаметром 0,61,5 см и ерошение чешуи по всему внешнему покрову. Молекулярно-генетический анализ со-скобов внешних покровов больных рыб выявил представителей родов Aeromonas (2 генотипа), Flavobacterium (1) и Saprolegnia (1), имеющих сходство с патогенными и условно патогенными микроорганизмами.

Представители рода Aeromonas являются широко распространенными эвригалинными эвритермными бактериями. Многие виды патогенны для позвоночных животных. Заболевания рыб, вызванные Aeromonas spp., в аквакультуре характеризуются высокой летальностью. Наиболее полно изучен «фурункулез» - системная болезнь лососевых рыб, вызываемая Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida [16]. Другие подвиды A. salmonicida вызывают системные и язвенные болезни у многих промысловых видов рыб [24]. Мезофильные аэромонады ( A.

hydrophila, A. caviae и A. sobria ), чаще всего поражают тепловодных прудовых рыб [35]. Клинические симптомы болезни представлены поражениями внешних покровов в хронических состояниях и септицемию (форма сепсиса, при которой наличие патогенных микроорганизмов в крови не сопровождается образованием очагов гнойного воспаления) в случаях острого заболевания.

Ранее заболевание и гибель окуня, вызванные бактериями рода Aeromonas, описаны в

1979 г. в альпийском озере во Франции [33]. От рыб с геморрагическими и язвенными клиническими симптомами был изолирован штамм A. hydrophila, патогенный для окуня и непатогенный для карпа и форели. Патогенный A. sobria явился причиной язвенной болезни окуня в аквакультуре [23]. В Швейцарии заболевания рыб, вызванные первичным инфекционным агентом A. sobria привели к значительным потерям европейского окуня P. fluviatilis в естественных водоемах [38].

lAerononas salmonid da subsp. sabnonicida CECT 894¹ (A¥9 87751)

• — Aeromonas salmonicida subsp. pectlnolytlca DSM 12609 ¹(AF134065)

Клон Yal-6

---Aeromoms salmonicTda subsp. smiihia CCM 4103¹ (AJ009859) lAerromosas saimonidda subsp. masoucida JCM7873 ¹ (AB027542)

' Aeron onas salnomclda subsp. achronogenes NCIMB 11 10 (X60407)

Aeromonas sobria NCIMB 1 2065^T (X60412)

p Аегожтas fiuviahs CECT740 1^T (FJ230078) Aeromoms aUosaccViarophtla CECT41 99^T (S39232)

• ■ Aeroinonas kydrophUa CCM 7232^T (DQ207728)

  
  

  Аегогвоиав kydrophtia subsp. rasas LMG 19707^т (AM26 2151)

p Aeromosas trata ATCC 49657^т (X 60415)

Asroisosas aquariorum MDC47^T (EU085557)

AeroiKonas hydrophiia subsp. dhakensis LMG 19562^T (AJ508765)

Asrassoms ichtkksmia DSM 6393^T (X71120)

Клон Yal-3

Aeramonas wronii bv. теле™ ATCC 35624 ¹ (X60414)

।— Asromosassckubertii ATCC 43700¹ (X60416)

---------Aeramosas slmiae IBS 56874 (AJ53682 1)

----------------------Aeron orcas sharmana GFTSA-6^T(DQ013306)

0.005

Рис. Бескорневое филогенетическое древо типовых штаммов Aeromonas и последовательностей, полученных из язвенных проявлений на внешних покровах окуня, построенное методом объединения ближайших соседей с использованием пакета программ Mega v3.1. Масштаб соответствует 5 заменам на 1000 п.н. Цифрой указана бутстреп поддержка ветвления кластера типового штамма Aeromonas veronii , рассчитанная по 100 репликам. В скобках указаны номера последовательностей типовых штаммов в базе данных; последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом.

Мы определили 2 генотипа, имеющие среди ближайших родственников филогенетически удаленные патогенные штаммы аэромонад (см. рис.). Клон Ya1-6 близок A. salmonicida, т.к. его последовательность формирует общий кластер с последовательностями типовых штаммов Aeromonas этого вида, не смотря на отличия в консервативной области 730-752 п.н. (по 16S рДНК A. salmonicida subsp. pectinolytica DSM 12609T, AF134065). Это широко известные патогенные для рыб штаммы, которые вызывают системные и язвенные болезни у многих промысловых видов рыб. Последовательность Ya1-3 кластеризуется с типовыми штаммами Aeromonas ichthiosmia DSM 6393T (X71120) и Aeromonas veronii bv. veronii ATCC 35624T (X60414). Эти штаммы признаны конспецифичными на основе полученных ранее молекулярных данных: филогенетического анализа по гену малой субъединицы РНК [17], ДНК-ДНК гибридизации [27] и результатов AFLP анализа [26]. Штамм A. vero-nii bv. veronii может вызывать геморрагическую септицемию у различных видов рыб [34]. Таким образом, полученные генотипы принадлежат видам аэромонад, мониторинг которых необходимо проводить регулярно для оценки состояния среды обитания водных организмов.

Представители рода Flavobacterium – известные этиологические агенты заболеваний «rainbow trout fry syndrome» (RTFS) и «bacterial cold water disease» (BCWD), вызывающие гибель лососевых Salmonidae [18] и аювых Plecoglossus altivelis [39] рыб в аквакультуре. F. psychrophilum первоначально определен как типичный патоген лососевидных рыб: заболевшие и мертвые рыбы в естественных условиях обитания являются источником распространения и заражения через водную среду обитания. В последнее время этот вид был выделен из воды, водорослей, экскрементов и органического детрита прудовых хозяйств. Кроме того, он отмечен у больных рыб как в аквакультуре: сазана Cypri-nus carpio , линя Tinca tinca , обыкновенного карася Carassius carassius , так и в природных популяциях речного угря Anguilla anguilla , закко Zacco platypus и лососевых [32]. Таким образом, существует несколько известных потенциальных резервуаров этой инфекции. Ранее F. psy-chrophilum культивировали [32] и определяли в ПЦР [28] у окуня в естественных водоемах, но предполагалось, что он является лишь носителем инфекции, т.к. на рыбах не регистрировали патологических проявлений. Активное развитие технологий культивирования окуня в некоторых странах послужило причиной возникновения пристального внимания к этому виду и его потенциальным патогенам. Появились сообщения о выделении и идентификации F. psychrophilum , связанного с некрозом тканей в области рта и со смертностью окуня в условиях аквакультуры [31]. Полученный нами генотип на проанализированном фрагменте гена 16S рРНК полностью совпадает с последовательностями разных штаммов F. psychrophilum . Следовательно, в данном контексте этот вид следует рассматривать как индикаторный и требующий дальнейшей разработки методов его определения и мониторинга.

Семейство Saprolegniaceae (Oomycetes) включает широко распространенные микроскопические водные грибы, которые обычно ведут сапрофитный образ жизни на растениях и животном дебрисе [30]. Представители некоторых видов могут также быть патогенными для растений [29], рыб [21, 40] и ракообразных [22]. Большинство этих видов, принадлежащих родам Achlya, Dictyuchus и Saprolegnia, являются этиологическими агентами микозов рыб. Они являются условно-патогенными организмами, которые вызывают заболевание «сапролегниоз». Заболевание широко распространено в случаях слишком высокой плотности рыбного населения [19]. Сапролегниоз часто сопутствует ряду инфекций и инвазий, осложняя их у травмированных или ослабленных особей. При этом наиболее опасными являются представители комплекса видов S. diclina-S. parasitica, для которых характерно образование вторичных кист и косвенное прорастание в здоровые ткани пораженных рыб. Нам удалось определить генотип, на исследованном участке не отличающийся от S. parasitica, что свидетельствует о существовании потенциальной угрозы массового поражения всего рыбного населения озера Арахлей и позволяет отнести этот вид к индикаторным микроорганизмам.

Следует отметить, что ранее гибель окуня с симптомами аэромоноза наблюдали и в других водоемах этого региона. Так, в 2004 г. в озере Шакша (Ивано-Арахлейские озера) в уловах были отмечены особи со схожими проявлениями на внешних покровах. Аналогичная ситуация в последние годы сложилась и в водоемах Республики Бурятия. В 2002-2003 гг. вспышка аэ-ромоноза зарегистрирована в озерах Еравно-Харгинской системы, в 2004 г. – в озере Гусином. Гибель окуня с похожими клиническими проявлениями описана в Чивыркуйском заливе озера Байкал и в Братском водохранилище [7, 10]. Очевидно, что возбудители аэромо-ноза присутствует в большинстве водоемов, а наличие или отсутствие гибели рыб и ее масштабы зависят в основном от факторов окружающей среды, влияющих на резистентность организма рыб, и сопутствующей микрофлоры. Мы определили комплексную этиологию этого заболевания и считаем, что все три агента Aero-monas , Flavobacterium и Saprolegnia являются ключевыми видами индикаторных микроорганизмов для мониторинга состояния среды обитания и инфекционных заболеваний рыб в озерах Забайкалья и республики Бурятия, основанного на современных, быстрых и эффективных методах.

Работа выполнена в рамках программы РАН № 26, подпрограммы 1, проект 26.13.