Определение изменения кинетических параметров роста Propioniba cterium Schermanii в зависимости от состава питательной среды

Потребности промышленности в витамине В12 удовлетворяются за счет микробиологического синтеза [1]. Витамин В12 активно продуцируется при глубинном культивировании Propionibacterium shermanii [5]. В отличие от ряда других витаминов витамин В12 прочно связан с протоплазмой и при жизни клеток в среду не выделяется. Поэтому необходимо, чтобы численность бактерий в 1 мл среды достигала более высокого уровня. В процессе ферментации в условиях закрытой системы возрастает негативное влияние лимитирующих факторов [3]. Известно, что в густых микробных популяциях быстрее потребляются питательные вещества и накапливаются продукты обмена, которые неблагоприятно влияют на скорость роста. Таким образом, чем выше численность клеток, тем ниже скорость роста, и наоборот. Величина удельной скорости роста, определяющая кинетические характеристики культуры, в значительной степени зависит от субстрата. Обычно витамин В12 синтезируют на среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта, сульфат аммония, предшественник нуклеотидной части витамина – 5,6-диметилбензимидазол (ДМБ). Предполагается, что при наличии в среде предшественников витамина В12 увеличиваются рост бактерий и продуктивность по данному витамину. Предшественником корриноидной части витамина В12 может служить порфирин крови [4]. Использование предшественника тетрапир-рольного цикла требует внесения определенных изменений в существующую биотехнологию. Наиболее существенной частью в этом алгоритме являются выбор и оптимизация состава питательной среды. Как известно, компоненты питательных сред определяют рост и строение микробных клеток. Выбирая питательные компоненты, можно создать условия для протекания определенных метаболических процессов с повышенной скоростью или подавить другую метаболическую деятельность. В самом приближенном виде состав питательных сред выявляется на основании химического состава клетки. При этом, однако, не учитываются состав и количество выделенных метаболитов. В связи с чем состав питательной сре- ды Propionibacterium shermanii устанавливали экспериментально с учетом выхода витамина В12 и знаний физиологии продуцента.

Цель исследования: изучить влияние порфирина крови крупного рогатого скота и состава питательной среды на скорость роста Propionibacterium shermanii.

Объекты и методы исследования

Работа проводилась с культурой Propionibacterium shermanii sp , полученной из Всесоюзного научно-исследовательского института молочной промышленности (г. Москва). Опыты ставились на питательных средах, состав и обозначение которых представлены в таблице 1.

Таблица 1

Состав питательных сред

Компоненты среды, г/л	Питательные среды
	№1	№2	№3
Кукурузный экстракт	20	-	-
Глюкоза	20	-	-
Лактат кальция	-	10	20
Дрожжевой экстракт	-	10	10
Гидролизат казеина	-	10	10
К 2 НРО 4	2,0	2,5	2,5
(NH 4 ) 2 SO 4	3,0
СоСl 2 `6H 2 O	0,02	0,02	0,02
H 2 O, мл	1000	1000	1000

В качестве посевного материала использовали 48-часовую культуру Р. Shermanii , выращенную на среде №1 [7]. Пропионовокислые бактерии выращивали при 30 ºС периодическим глубинным способом в стационарных условиях в течение 120 ч. Содержание в культуральной жидкости витамина В 12 определяли спектрофотометрическим методом на 96 ч культивирования после предварительной дезинтеграции клеток и осаждения белков [6]. Среды стерилизовали при 0,5 атм. в течение 20 мин.

Порфирин крови добавляли в количествах 5, 10, 25, мг/л, который был выделен из крови убойных животных, предварительно обработанной биотехнологическим способом, разработанным на кафедре «Биотехнология» ВСГУТУ [2]. Совмещали процессы введения порфирина в питательные среды и поддержания в ней благоприятного уровня рН (6,8-7,0). Вместо раствора соды добавляли щелочной раствор порфирина.

Метод определения живых клеток бактерий основан на способности факультативноанаэробных микроорганизмов размножаться на плотной питательной среде при 37±1 °С в течение 48 ч. Разведения культуральной жидкости засевали в количестве 0,5 мл на чашки Петри и сверху заливали расплавленной и охлажденной до 40 °С питательной средой [7]. Биомассу определяли методом высушивания после ее отделения от культуральной жидкости [6].

Результаты исследования

Проведены исследования влияния порфирина на процесс накопления Propionibacterium shermanii витамина В 12 . Установлено, что при культивировании Р. Shermanii на питательной среде состава № 3 продуктивность по витамину В 12 выше, чем на среде состава № 1 (рис. 1).

Исследовали влияние порфирина на показатели роста культуры Р. shermanii .

Определены значения концентраций биомассы бактерий – абсолютно сухая биомасса (АСБ) в зависимости от содержания источников углерода и порфирина крови. В качестве источника углерода для биосинтеза пропионовокислых бактерий (ПКБ) использованы глюкоза и лактат Са (табл. 1). Результаты исследований биомассы бактерий, полученных на контрольных средах, содержащих в качестве источника углерода лактат кальция и глюкозу, представлены на рисунке 2.

Рис. 1. Выход витамина В 12 в зависимостиот концентрации порфирина крови в питательных средах

Рис. 2. Динамика изменения биомассы Р. shermanii при культивировании на питательных средах № 1, 2

Из рисунка 2 видно, что выход биомассы Р. shermanii значительно выше на среде с лактатом Са, чем на среде с глюкозой. Использование в качестве источника углерода лактата создает селективные условия для роста пропионовокислых бактерий.

Изменение количества биомассы Р. shermanii в зависимости от количества вносимого в питательную среду порфирина крови представлено на рисунке 3. Оценивая влияние порфирина крови на рост биомассы пропионовокислых бактерий, можно констатировать, что увеличение концентрации биомассы получено в экспоненциальной фазе роста при введении 10 мг порфирина на среде № 3.

Прирост биомассы P. shermanii за 72 ч культивирования на средах № 2 и № 3, содержащих 5, 10, 25 мг/л порфирина крови демонстрируют данные в таблице 2. Видно, что активный рост культуры P. shermanii в присутствии порфирина крови определяется не только его концентрацией, но и количеством лактата в среде. Так, содержание лактата в количестве 10 г/л не обеспечивает уровень прироста биомассы P. shermanii , который был получен при культивировании на средах с 20 г/л лактата и разных концентрациях порфирина.

время культивирования, ч

Рис. 3. Кинетика биомассы P. shermanii на среде с лактатом Са в концентрации 20 г/л

Таблица 2

Удельная скорость роста культуры P. shermanii

Концентрация порфирина, мг/л	Удельная скорость роста µ ч-1
	Среда №2	Среда №3
5	0,0065	0,091
10	0,008	0,11
25	0,0115	0,083
контроль	0,0125	0,076

Кинетика роста клеток P. shermanii в зависимости от источника углерода показана на рисунке 4. В данном случае обнаружена обратная зависимость; количество клеток пропионовокислых бактерий выше при культивировании на среде с глюкозой, чем на лактатной среде.

Для определения удельной скорости деления культуры при различных концентрациях порфирина крови строили график в системе координат {LnN;t}. Из графиков зависимости числа клеток от времени, представленных на рисунке 5, видно, что культивирование на средах, содержащих 5, 10 мг/л порфирина, позволяет получить количество клеток культуры пропионовокислых бактерий практически одинаковое с таковым на контрольной среде № 1

При этом отсутствует лаг-фаза, переход к стационару наблюдается через 48 ч, стадия отмирания клеток имеет место через 80 ч культивирования.

Из графиков зависимости числа клеток от времени, представленных на рисунке 6, видно, что культивирование на средах сочетающих 5-10 мг/л порфирина и 10 г/л лактата, эффективность прироста выше, чем на контрольной среде № 2.

время культивирования, ч

Рис. 4. Кинетика роста P. shermanii на средах № 1, 2

на кинетику роста P. shermanii на среде № 1

с 25

порфирина

—ф 5 мг/л порфирина

—■- 10мг/л порфирина время культивирования, ч

Рис. 6. Влияние концентрации порфирина крови на кинетику роста P. shermanii на среде № 2

Результаты исследований влияния разных концентраций порфирина на удельную скорость деления можно оценить с помощью данных, приведенных в таблице 3.

Таблица 3

Концентрация порфирина мг/л	Удельная скорость деления ν ч-1
	среда №1	среда №2
5	0,1107	0,0949
10	0,1109	0,0962
25	0,0986	0,0961
контроль	0,1228	0,0976

Удельная скорость роста P. shermanii

Введение порфирина крови в состав питательной среды № 1 снижает скорость размножения клеток P. shermanii на 10-20%, а в питательной среде № 2 - на 1-3%, в зависимости от концентрации тетрапиррола.

Выводы

• 1.    Показано стимулирующее действие лактата Са на накопление биомассы культуры P. shermanii sp.

• 2.    Показано ингибирующее действие лактата Са на рост P. shermanii sp.

• 3.    Установлено, что введение порфирина крови в концентрациях 5, 10, 25 мг/л увеличивает рост P. shermanii sp на питательных средах с лактатом.

• 4.    Установлено, что введение порфирина в концентрациях 5-10 мг/л обеспечивает удельную скорость роста клеток равную таковой на среде с глюкозой и более высокую, чем на среде с лактатом.

• 5.    Показано, что введение 25 мг/л порфирина крови в питательные среды уменьшает скорость роста клеток P. shermanii sp.