Определение количества внеклеточных ДНК крови методом ПЦР, специфичной к B-актину и Line -1 последовательностям при раке легкого

Важнейшим условием успешного лечения немелкоклеточного рака легкого (РЛ) является его обнаружение на ранних стадиях. Показано, что при развитии различных опухолей наблюдается изменение концентрации и состава внеклеточных ДНК (внДНК) в плазме крови. Для разработки чувствительного и специфичного метода детекции РЛ на основе анализа внДНК крови представляется актуальным выявление изменений количества внДНК в плазме и во внДНК фракции, связанной с клеточной поверхностью, на разных стадиях заболевания.

Цель исследования – сравнительный анализ в норме и при РЛ количества внДНК в различных фракциях крови методом ПЦР в реальном времени, специфичной к фрагментам однокопийного гена β-актина и повторяющихся последовательностей LINE-1.

Материал и методы. В исследование включено 20 здоровых доноров и 60 больных операбельным НМРЛ (T1—3N0—3M0), диагноз морфологически верифицирован. Кровь разделяли на плазму и клетки крови, фракцию внДНК, связанных с клеточной поверхностью, получали последовательной обработкой клеток фосфатным буфером, содержащим ЭДТА, и раствором трипсина. В полученных фракциях крови определяли количество внДНК при помощи ПЦР.

Результаты. По данным ПЦР-анализа фрагментов в—актина и LINE-1 повторов количество внДНК в плазме крови достоверно не изменяется у больных НМРЛ по сравнению с нормой. При этом показано, что при НМРЛ количество внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, достоверно снижается (163±20 нг/мл – по β-актину; 47±9 нг/мл – по LINE-1 и 294±56 нг/мл – по β-актину; 171±28 нг/мл – по LINE-1) (р=0,009 и р=0,002). Методом ПЦР, специфичной к в—актину, выявлены достоверные различия в количестве внДНК, связанных с поверхностью клеток, между пациентами с различным гистотипом НМРЛ: плоскоклеточном раке и аденокарциномой (р=0,04). У больных НМРЛ с первичной опухолью T1-2 и без лимфогенных метастазов количество внДНК по данным анализа β-актина достоверно выше, чем при Т3 с метастазами (р=0,02). При умереннодифференцированном плоскоклеточным РЛ количество внДНК достоверно выше, чем при низкодифференцированном РЛ – 214±39 нг/мл и 133±20 нг/мл соответственно (р=0,03). Соотношение количества внДНК по анализу фрагментов гена β-актина и последовательностей LINE-1 в плазме крови у здоровых и больных НМРЛ значимо не отличается (1,6 и 1,9 р=0,06). При этом во внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, соотношение β-актина к LINE-1

повторам при НМРЛ достоверно выше, чем в норме – 3,4 и 1,7, соответственно (р=0,007).

Выводы. Изменение количества внДНК по данным ПЦР, специфичной к фрагментам одно-копийного гена β-актина и LINE-1 повторов во внДНК крови, связанных с клеточной поверхностью, может служить дополнительным критерием при выявлении рака легкого. Полученные данные о взаимосвязи количества этих ДНК-маркеров с клинико-морфологическими параметрами опухоли говорят о перспективности дальнейших исследований в плане оценки их прогностической значимости.

Работа выполнена при поддержке гранта СО РАН N 12, выполняемого совместно со сторонними научными организациями, гранта РФФИ 09-04-01334а.