Определение микробной чувствительности к экстрактам из личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) и их продуктов жизнедеятельности

Введение. Наращивание темпов роста сельского хозяйства приводит к увеличению объемов применения антибактериальных средств в животноводстве, следствием чего является формирование и распространение антибиотикоустойчивых штаммов бактерий и микромицетов. Использование широкого спектра антибактериальных и ветеринарных лекарственных средств в животноводстве увеличивает риск контаминации пищевой продукции [1, 2]. Европейская сеть по эпиднадзору за устойчивостью к антимикробным препаратам («EARS-Net») ежегодно регистрирует до 400 000 случаев развития по-лирезистентных инфекций [3, 4]. Бактериальный ответ на «атаку» антибиотика - это яркий пример бактериальной адаптации и вершина эволюции. Поэтому понимание биохимических и генетических основ резистентности имеет первостепенное значение для разработки стратегий по ограничению ее возникновения и распространения, а также создание новаторских терапевтических подходов в отношении организмов, устойчивых ко многим лекарственным препаратам [5]. Одно из перспективных решений данной проблемы - поиск синергетических взаимодействий антибиотик плюс агент, обладающий ингибирующим действием в отношении патогенной микрофлоры. В качестве данного агента могут быть использованы разработанные пре- параты на основе ингибированных в-лактамаз. Данный механизм защиты является одним из основных для таких важных возбудителей, как S. aureus, Н. influenzae, M. catarrhalis, В. fragilis, K. pneumomae [6].

В качестве агента, усиливающего действие антибиотика, могут быть использованы антимикробные пептиды, которые по силе действия сопоставимы с антибиотиками [7, 8]. Резистентность формируется за счет комплекса следующих механизмов: 1) способности накапливать в матриксе внеклеточные ферменты, разрушающие антибиотики; 2) уменьшения площади открытой поверхности клеток при агрегационной природе биопленок; 3) сниженного метаболизма микроорганизмов в биопленке; 4) активного обмена генетической информацией при рекомбинациях, контролирующих передачу генов резистентности к антимикробным препаратам [8-10].

В настоящее время известно, что экстракт из личинок большой восковой моли (Galleria mellonella L.) проявляет высокую активность в отношении многих микроорганизмов: Mycobacterium tuberculosis, Corinebacterium difteria, Clostridium tetani, Yersinia pestis и др. [11]. Проведены исследования биологически активных пептидных компонентов гемолимфы личинок G. mellonella в условиях их предварительной спе- цифической и неспецифической иммунизации, экстрагирования этиловым спиртом, выделения и изучения методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и МАЛДИ-анализа. Изучение антибактериального действия спиртовых экстрактов показало наличие бактериостатического действия по отношению к E. сoli и Bacillus cereus [12]. Доказано, что микробиом личинок G. mellonella, не подвергавшихся воздействию антибиотиков, несет ряд генов устойчивости к тетрациклину, что указывает на потенциал разнообразного пула генов, устойчивых к антибиотикам ряда тетрациклина [13]. Часть пептидных компонентов гемолимфы личинок восковой моли эффективно экстрагируется 34 %-м этиловым спиртом, что обусловливает ингибирующее действие данных экстрактов на рост грам(-)бактерий [14].

Исходя из анализа литературных данных, раствор из личинок G. mellonella может быть потенциально ингибирующим агентом, усиливающим действие антибиотика. В перспективе полученные эффекты помогут решить проблему антибиотикорезистентности с возможностью использования в медицине, биотехнологии и ветеринарии.

Цель исследования: изучить синергетическое взаимодействие антибиотиков и различных растворов из личинок большой восковой моли ( Galleria mellonella L.) и ее продуктов жизнедеятельности.

Задачи исследования: выявить антибиоти-корезистентность условно-патогенного микроорганизма E. coli с добавлением агента в виде водного раствора из личинок G. mellonella, усиливающего действие антибиотика; выявить ан-тибиотикорезистентность условно-патогенного микроорганизма E. coli с добавлением агента в виде водного раствора из продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella, усиливающего действие антибиотика.

Методы и объекты исследования. Для проведения исследования применялись «Методические рекомендации по лабораторному содержанию и разведению большой восковой огневки Galleria mellonella L.» [16]. Эксперименты проводились в соответствии со следующими работами: «Лабораторный практикум по микробиологии» [17], «Микробиология с техникой микробиологических исследований» [18]. Исследования влияния растворов G. mellonella на антибактериальную активность 11 антибиотиков (энрофлоксацин , стрептомицин, цефазолин, эритромицин, пенициллин, неомицин, левоми-цитин, доксициклин, гентомицин, ликомицин, тилозин) проводились в отношении Escherichia coli. Культура E. coli культивировалась в термостате при +28–37 ºС на мясопептоном агаре. Изучение роста колоний микроорганизмов E. coli оценивали на первые сутки в трехкратной повторности с применением диско-диффузионного метода. В стерильных условиях диски с антибиотиками добавляли в зараженную среду чашек Петри . В каждой чашке Петри располагали по 4 диска с разными антибиотиками. На каждый диск автоматической микропипеткой раскапывали изучаемые растворы определенной концентрации, одинакового объема (табл. 1).

Таблица 1

Схема эксперимента по изучению синергетического взаимодействия антибиотиков и растворов из G. Mellonella

Группа	Раствор	Концентрация, %	Объем
Контроль	Стерильный физиологический раствор		0,01 мл
1-я опытная	Водный экстракт личинок G. mellonella (ВЭЛ)	10 25
2-я опытная	Легкая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (ЛФ ПЖ)	10 15 20 25
3-я опытная	Тяжелая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (ТФ ПЖ)	10 15 20 25

Водный экстракт личинок G.mellonella готовили в два этапа. Первый этап – нативных личинок экстрагировали 40 % этанолом на период 21 сут. Второй этап – полученный экстракт высушивали на открытом воздухе до образования сухого вещества, к которому добавляли дистиллированную воду, доводя до нужной концентрации. Фракции продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella получали поэтапным экстрагированием 40 % этанолом. Полученный осадок – тяжелая фракция, надосадочная жидкость – легкая фракция. Для определения синергии ан- тибиотиков и изучаемых растворов проводили инкубацию E. coli в термостате при +37 ºС и через 24 ч. Учитывали площадь зоны ингибирования роста условно-патогенной микрофлоры [19].

Результаты исследования и их обсуждение. Было проведено определение активности антибиотиков в композиции с различными формами личинок G. mellonella и ее продуктами жизнедеятельности. Уровень антибиотикорези-стентности определяли по площади зоны ингибирования культуры E. coli , результаты представлены на рисунке 1 .

Физиологический раствор (контроль)

Водный экстракт личинок

G. mellonella (1-я опытная группа)

Легкая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (2-я опытная группа)

Тяжелая фракция продуктов жизнедеятельности личинок G. mellonella (3-я опытная группа)

Рис. 1. Зоны ингибирования роста E. coli с использованием дисков с антибиотиками, пропитанные разными растворами G. mellonella

Среднее значение зоны ингибирования опытных групп по энфлоксацину составило 16,01 мм2, что больше, чем в контроле, на 19,1 %. Наиболее достоверные выдающиеся результаты получены с 25 % ВЭЛ и 15 % ЛФ

ПЖ. Также высокую эффективность антибити-корезистентности показали 15 % раствор ТФ ПЖ G.mellonella (на 34,2 % больше, чем в контроле), однако данные не достоверны (табл. 2).

Таблица 2

Площадь ингибирования роста E.coli в композиции с формами личинок G.mellonella , мм²

Среднее значение зоны ингибирования опытных групп по цефазолину - 7,72 мм², что больше, чем в контроле, на 49,3 %. Максимальное достоверное значение площади ингибирования роста E. coli составил у 15 % ЛФ ПЖ -14,59 мм². Раствор 15 % ЛФ Пж также показал высокие достоверные результаты - на 111 % больше, чем в контроле.

Результаты опыта по ингибированию площади по стрептомицину показали, что средние значения опытных групп на 14,7 % выше, чем в контроле. Достоверные результаты получены в сочетании с 10; 15; 20 и 25 % растворами ЛФ ПЖ. Аналогичные результаты получены с неомицином. Средние значения площади зоны ингибирования на 62,2 % выше контрольных значений. Площадь ингибирования у неомицина совместно с водным экстрактом G. mellonella и ПЖ в среднем на 62,2 % выше, чем в контроле. Из всех опытных групп максимальную площадь ингибирования роста E. coli достоверно выявлено 25 % ТФ ПЖ и 15 % ЛФ ПЖ.

Результаты ингибирования роста кишечной палочки левомицетином в композиции с изучаемыми формами в среднем на 60,3 % выше, чем в контроле, что так же, как в предыдущих экспериментах, указывает на эффективность подавления роста условно-патогенной микрофлоры. Максимальные значения площади ингибирования - в композиции с 10 и 15 % ЛФ ПЖ.

Доксициклин совместно с формами G. mellonella в среднем продемонстрировал лучшее подавление условно-патогенной микрофлоры (на 96,6 %) по сравнению с контролем. Из всех рассматриваемых форм максимальная площадь ингибирования отмечается с 15 % ЛФ ПЖ и ТФ ПЖ.

Исследуемые формы G. mellonella в композиции с гентамицином показали следующие результаты. Среднее значение зоны ингибирования опытных групп на 59,1 % выше, чем в контроле. Максимальная площадь зоны ингибирования наблюдались в сочетаниях с 10 и 15 % ЛФ ПЖ (P < 0,001). По ряду антибиотиков (лин-комицин, эритромицин, бензилпенициллин, ти-лозин) в контроле выявлена антибиотикорези-стентность штамма E. сoli . В связи с этим в дальнейших исследованиях данные антибиотики будут исключены.

Наибольшая эффективность в отношении E. coli отмечена в композициях 15 % ЛФ и ТФ с эн-рофлоксацином, цефазолином, неомицином, левомицетином, доксициклином, гентомицином. Разница по опытным группам достоверна. Средняя эффективность композиции антибиотиков с формами G. mellonella наблюдается со стрептомицином (P < 0,001).

Изучение влияния синергетических свойств антибиотиков и продуктов G. mellonella показало, что площадь ингибирования 15 % раствора ЛФ ПЖ достоверно больше в среднем в 2-2,5 раза со всеми антибиотиками (при P < 0,001), за исключением эритромицина. Далее выявлена достоверная синергия 15 % раствора ТФ ПЖ и 25 % раствора ЛФ ПЖ, особенно в сочетании с антибиотиками левомицитин, энрофлоксацин, гентомицин, доклицитин (при P < 0,001). Минимальная площадь ингибирования, близкая к контрольным значениям, - водный экстракт личинок, 20 % растворы ЛФ и ТФ ПЖ. В отдельных случаях 10 % раствор ЛФ ПЖ показал большую площадь ингибирования в сочетании с энро-флоксацином, левомицитином, неомицином.

В данном эксперименте отмечена высокая степень синергии по площади ингибирования с 15 % растворами ЛФ ПЖ и ТФ ПЖ. Используемая культура микроорганизмов показала высокую степень резистентности к эритромицину, пенициллину, линкомицину. В связи с этим дальнейшее изучение этих антибиотиков было не целесообразно, и они были исключчены из эксперимента.

Выводы

• 1.    Водный экстракт личинок большой восковой моли не проявлял бактериальной активности в отношении E. coli.

• 2.    Продукты жизнедеятельности личинок G. mellonella ослабляют антибиотикорезистент-ность E. coli и усиливают действие ряда антибиотиков (левомицитин, энрофлоксацин, гентомицин, доклицитин), что важно при решении проблемы их устойчивости в животноводстве и других сферах деятельности человека. Целесообразно продолжить исследования в данном направлении.