Определение оптических толщин слоистых объектов по интерференционным цветам изображений в микроскопии белого света

В оптической микроскопии для визуализации и измерений фазовых объектов используются интерференционные методы, которые имеют высокие осевое разрешение, точность измерений и чувствительность, по сравнению с обычной микроскопией, и достаточно широкие функциональные возможности в технологических и биомедицинских приложениях [1–6]. Эти методы и средства их реализации, объединенные в единую область – интерференционную микроскопию, занимают важное место в решении задач контроля микроструктуры отражающих и прозрачных объектов в технике и биомедицине. При наблюдении и анализе фазовых объектов с применением обычной микроскопии возникают трудности их визуализации ввиду низкого контраста объект – фон [2]. Кроме этого, осевое разрешение обычных микроскопов, ограничиваемое числовой апертурой объектива [2, 7], оказывается недостаточным для анализа объектов с толщиной в микронном и субмикронном диапазонах.

К интерференционным методам микроскопии относятся: интерференционная микроскопия с использованием низкокогерентных и лазерных источников света [4–6, 8, 9], голографическая аналоговая и цифровая микроcкопия [10, 11], полнопольная когерентная томография [12, 13], дифракционная фазовая микроскопия [14], интерференционная конфокальная микроскопия [15]. Отличительной стороной этих методов служит регистрация, анализ и обработка интерференционных картин, изображений и сигналов.

Методы интерференционной микроскопии основаны на когерентном сложении поля изображения объекта с когерентной ему опорной волной. В результате такого сложения формируется интерференционное изображение, параметры которого зависят от микроструктуры исследуемого объекта, частотного спектра и временной когерентности, углового спектра и пространственной когерентности освещающего объект поля. Интерференционные изображения возникают и в обычной микроскопии в отсутствие специально сформированного опорного пучка света. Такие эффекты интерференции обусловлены когерентным характером формирования изображений, когда микроскопом разрешается область пространственной когерентности освещающего волнового поля [2, 7], и в том случае, когда объект имеет тонкую слоистую структуру, оптическая толщина которой не превышает половины длины продольной когерентности освещающего объект поля – когда отраженные границами слоев волны оказываются взаимно когерентными [7].

Особый интерес представляют интерференционные эффекты в тонких пленках [7, 16 – 20]. При освещении белым светом пленки ее микроскопическое изображение приобретает интерференционную окраску, которая зависит от её оптической толщины. Кроме того, на цвет влияют и другие факторы – спектральный состав излучения, амплитудные коэффициенты отражения света от объекта и фазовые сдвиги волн при отражении от ее поверхности, коэффициент поглощения слоя пленки и его спектральная зависимость, спектральные параметры как самого объекта, так и регистрирующей изображение аппаратуры.

В технике методы анализа интерференционных цветов используются для измерения толщины диэлектрических и полупроводниковых пленок [17, 19], контроля за толщиной смазочных покрытий [20, 21], измерения толщин окисных пленок на поверхности металлов и полупроводников, толщины зазоров между поверхностями диэлектриков в оптической промышленности [22, 23], а также для определения механических напряжений в прозрачных средах, в частности, при производстве технического стекла, изделий из стекла и пластика [24].

Существенным недостатком этих методов является субъективное восприятие и оценка цвета картины, наблюдаемой непосредственно в системе микроскопа или отображаемой средствами компьютерной техники, используемой для записи и наблюдения изображений. Для устранения этой субъективности необходима разработка компьютерного алгоритма анализа цвета интерференционной картины.

С физической точки зрения ключевая задача в разработке методов и алгоритмов анализа интерференционных цветов сводится к теоретическому описанию процессов формирования и цифровой записи интерференционных изображений слоистых объектов в микроскопии. В работе [9] рассматривается интерференционный микроскоп Линника и формирование в нем интерференционных изображений с использованием опорной волны. Основное внимание уделяется рассмотрению интерференционных картин и интерференционных сигналов, образующихся в результате интерференции опорной волны с объектными волнами, отраженными границами слоев объекта. Использование опорной волны предопределило введение дополнительной плоскости отсчета, относительно которой вводятся разности хода всех интерферирующих волн. Полученные математические выражения для интерференционных изображений допускают переход к случаю отсутствия опорной волны, но в работе в основном рассматриваются процессы формирования и компьютерного моделирования интерференционных изображений и сигналов с использованием опорной волны, в том числе и в случае относительно толстых слоев, когда отсутствует интерференция волн, отраженных границами слоя. И не рассматривается возможность решения обратной задачи – проведения измерений оптической толщины слоев по цветам интерференционных изображений путем количественного сравнения цветов экспериментальных и смоделированных изображений. Наша работа направлена на решение именно этой задачи с использованием теоретических подходов из [9].

В рамках данной работы рассмотрена теория формирования цветных интерференционных изображений слоистых объектов в белом свете в микроскопах без опорного плеча с учетом влияния параметров системы цифровой записи изображения, коэффициентов отражения от границ объекта и возникающих фазовых сдвигов отраженных волн. К целям и задачам данной работы относится рассмотрение вопросов регистрации цветных изображений цифровыми средствами записи, влияние их спектральных свойств на результат записи, возможность использования количественных данных цветов интерференционных картин для реализации метода определения оптических толщин слоистых микрообъектов по интерференционным цветам их изображений.

1.    Формирование интерференционного изображения слоистого объекта

Вид изображения в микроскопе может существенным образом зависеть от условий освещения объекта, спектрального состава и когерентных свойств излучения [2]. Свойства освещающего излучения проявляются в параметрах изображений микрообъектов при реализации режимов некогерентного, частично когерентного или когерентного формирования изображений, а также в интерференционных изображениях объектов со слоистой структурой. Формальный анализ процессов формирования интерференционных изображений наиболее прост и нагляден в режиме пространственно когерентного освещения объекта – при освещении квазиплоской волной. В микроскопии отражающих объектов (рис. 1) такой режим устанавливается при использовании в осветительной системе достаточно малой апертурной диафрагмы, отображаемой конден-сорной линзой в заднюю фокальную плоскость микрообъектива – освещение по Кёллеру [2, 7]. В этом случае объект освещается квазипараллельным пучком света – в каждую точку его поверхности падает пучок лучей с малой угловой апертурой, определяемой размерами изображения апертурной диафрагмы и фокусом объектива. Если при этом размер зрачка объектива существенно превышает размеры изображения апертуры освещающей системы, то в микроскопе реализуется режим пространственно когерентного освещения и когерентного формирования изображения структуры объекта [2, 7]. На рис. 1 представлена оптическая схема микроскопа с записью цифровых изображений от-

Рис. 1. Схема микроскопа: S – протяженный источник света, L1, L2 – линзы осветительной системы, AS – апертурная диафрагма, FS – диафрагма поля зрения, BS – делитель пучка, MO – микрообъектив, OB – объект, TL – тубусная линза, MP – матричный фотодетектор

При исследовании объектов с прозрачной слоистой структурой дополнительные интерференционные эффекты возникают в результате сложения волн, отраженных границами слоев. Для таких интерференцион- ных эффектов необходимо, чтобы оптическая толщина слоя была меньше половины длины продольной когерентности освещающего поля. При использовании полихроматического света в этом случае возникает цветная интерференционная картина при визуальном наблюдении или при записи изображения с помощью цветных фотодетекторов. Такому условию соответствуют пленки толщиной от долей до единицы микрометра, поскольку длина временной когерентности видимого света составляет ® 2,3 мкм.

В оптических микроскопах, как правило, используется протяженный пространственно некогерентный источник белого света – лампа накаливания или светодиод. Использование такого источника необходимо из энергетических требований и для реализации режима пространственно квазинекогерентного освещения объекта и, соответственно, квазинекогерентного процесса формирования изображения, что во многих практических случаях оказывается предпочтительнее когерентного или частично когерентного режимов формирования изображения [2]. Использование регулируемой апертурной диафрагмы AS (рис. 1), переотображаемой конденсорной линзой L2 в заднюю фокальную плоскость микрообъектива MO, позволяет создавать режим пространственно когерентного освещения объекта и когерентного формирования изображения. При минимальной диафрагме ее изображение в задней фокальной плоскости микрообъектива становится почти точечным, и в этом случае объект освещается вдоль оптической оси почти плоской волной. В теоретической части данной работы рассмотрен именно такой режим работы микроскопа для упрощения формального анализа формирования интерференционных изображений. Длина продольной когерентности в этом случае равна длине временной когерентности, определяемой только шириной частотного спектра света [7]. Однако при использовании широкой апертурной диафрагмы и, соответственно, освещении объекта полем с широким угловым спектром продольная длина когерентности поля становится зависимой от ширины частотного и ширины углового спектров поля [25, 26], что должно проявиться в интерференционных изображениях, в том числе и в его интерференционном цвете.

При исследовании слоистых объектов отраженное объектом волновое поле состоит из нескольких волн, отраженных границами слоев. В простейшем, но часто встречающемся на практике случае однослойного объекта в формировании интерференционного изображения участвуют две волны. Эти волны могут быть взаимно когерентными, создавая интерференционное изображение объекта, если их оптическая разность хода Δ, возникающая при прохождении светом слоя и отражении от его границ, оказывается меньше длины временной когерентности волнового поля lc, воспринимаемого фотодетектором. При использовании источника белого света в изображении возникают интерференционные эффекты, создавая цветовую окраску в изображении во всем диапазоне цветовой шкалы при его визуальном наблюдении. При исполь- зовании цветных матричных фотодетекторов и компьютерной визуализации изображений регистрируются и воспроизводятся цветные интерференционные изображения, как правило, отличающиеся от визуально воспринимаемых этих же изображений. Поэтому математическая модель интерференционного изображения должна учитывать как спектральные свойства источника света, так и регистрирующей аппаратуры, а также цветовые модели формирования цифровых изображений.

Цветное интерференционное изображение можно представить в виде некогерентной суперпозиции монохромных изображений, формирующихся на разных длинах волн. Цвет результирующего изображения определяется соотношением интенсивностей этих изображений. Интенсивность интерференционного изображения на определенной длине волны зависит от разности фаз А ф интерферирующих волн, которая определяется оптической разностью хода волн Δ в слое объекта и фазовыми сдвигами ф 1 и ф ₂, возникающими при отражении волн от границ слоя:

2π

М = — ^{А + ( ф} ! ^{— ф} 2 ),

где Δ зависит от толщины слоя d , его показателя преломления n и угла падения волны θ (рис.2):

А = 2 d^n ² - n 2 sin² ( 9 ) ,                         (2)

где n 0 – показатель преломления среды до слоя.

Рис. 2. Оптическая разность хода волн, отраженных границами слоя толщиной d с показателем преломления n на поверхности подложки при падении квазиплоской волны под углом θ из среды с показателем преломления n 0

При нормальном падении света на поверхность объекта, θ≈0, оптическая разность хода становится равной Δ ≈ 2 dn . Вариации угла падения θ в небольших пределах при почти нормальном падении не вносят существенных изменений в разность хода Δ, и приближенное выражение Δ ≈ 2 dn можно использовать при освещении объекта полем с достаточно малой угловой апертурой и при небольших наклонах объекта относительно оптической оси микроскопа. Однако при освещении объекта полем с широкой угловой апертурой, что происходит при широко открытой апертурной диафрагме системы освещения, разность хода Δ волн, отраженных границами слоя, существенно зависит от ширины угловой апертуры поля, и это необходимо учитывать в эксперименте и в математической модели интерференционного изображения слоя как в монохроматическом, так и в полихроматическом свете.

Интенсивность изображения I ( р ) однослойного объекта с двумя отражающими границами, как наблюдаемая в эксперименте величина, пропорциональна среднему по времени квадрату модуля суммы полей [7], отраженных границами слоя:

I (^р) ~^| E 1 ( t , ^р) + E 2 ( t , ^р)|^ =

= 1 1 ( р ) + 1 2 ( р ) + ^2Re ( E ( t , р ) E 2* ( t , р )} =             ⁽³⁾

= 11 (р ) + I2 (р ) + 2Re Г12 (р ) , где (...) - усреднение по времени, эквивалентное усреднению по ансамблю реализаций стационарных волновых полей; 11 (р) = ^E (t, р)| ^ и 12 (р) = (E2 (t, р)| ^ — интенсивности отраженных границами слоя полей; Г12 (р) = EE1 (t, р)E*(t, р)^ -функция взаимной когерентности возмущений полей в различных точках р(x,у) изображения [26].

В случае, когда отражение и пропускание границ слоя, его поглощательная способность и коэффициент преломления сильно зависят от частоты света, то интерферирующие волны будут иметь отличающийся спектральный состав и, следовательно, эффекты интерференции будут определяться взаимным спектром и взаимными когерентными свойствами интерферирующих волн. В более простых условиях, когда отражающие и пропускающие свойства объекта практически не зависят от частоты света ω, можно считать, что на фотодетектор приходят две волны с одинаковым спектральным составом. В этом случае функция взаимной когерентности Г ₁₂ ( р ) может быть выражена [26] через функцию автокогерентности -временной когерентности - одного из интерферирующих полей, Г ₁₂ ( р )~ Г_п ( р , А ), где А - оптическая разность хода волн. Если энергетические коэффициенты отражения границ слоя R 1 и R ₂ не зависят от частоты и, то (3) можно записать в виде:

I ( р ) = I о ( р ) [ R i ² + R 2 ( 1 - R i ) ² +

+24RR2 (1 — R )|т(А(р))|]х

(2л. ,-,)

х cos —А ( р ) + Аф₁₂ + ф ,

1Хо где 10 (р) - интенсивность света в изображении поверхности подложки в отсутствие объекта при полном отражении от поверхности подложки, у(А(р)) =

^Г 11 ( ^р , ^А ( ^р ))/^Гн ( ^р , ^А = ⁰ ) = ^Г 11 ( ^р , ^А ( ^р ))/ I о ( ^р ) ^- комплексная степень временной когерентности света, Х о - средняя длина волны света, А ф 12 = Ф 1 - Ф 2 , ф = arg у ( А ) - 2 пА ( р )/ Х о .

Выражение (4) определяет изменение интенсивности изображения в зависимости от разности хода

А ( р ) в различных точках изображения. Если А ( р ) превышает длину когерентности l c , то взаимная когерентность складываемых колебаний нарушается и функция | у ( А )| стремится к нулю. В этом случае происходит некогерентное сложение волн и картина интерференции исчезает.

Выражение (4) позволяет проводить компьютерное моделирование интерференционного изображения тонкой пленки с изменяющейся толщиной d ( р ) в градациях серого с заданными свойствами оптической системы. Для оптического поля в изображении необходимо знать его среднюю длину волны Х о , ширину спектра Δλ и аналитическое выражение для модуля степени когерентности | у ( А )|, которое можно представлять в виде Гауссовой функции: |у( А )| « exp ( -А ²/l 2 ) , где l c - длина когерентности, определяемая шириной спектра АХ , lc «Х о / АХ [7].

Использование выражения (4) эффективно при моделировании интерференционных изображений в градациях серого. При моделировании цветных интерференционных изображений необходимо использовать спектральное представление интерферирующих волновых полей и, соответственно, спектральное представление всего интерференционного уравнения.

2.    Спектральное представление уравнения интерференции

При формальном описании интерференционного изображения в белом свете и регистрации его цифровыми устройствами следует учитывать спектральные свойства оптической системы и матричного фотодетектора [9]. Для этого необходимо использовать спектральную форму записи волновых полей [7]:

да

E _о ( р , t ) = J g ( ю ) т ( ю ) f ( to ) exp ( i to t ) d to ,           (5)

о

E ( р , t ) = E о ( р , t - А t 1 ( р ) ) V R 1 ( to ) exp ( i ф , ) =

= J jR^exp ( i Ф 1 ) g ( to ) T ( to ) f ( to ) x              (6)

о x exp (ito[t - Аt1 ]) dto,

E2 (р, t) = Eо (р, t -А12 (р))x x./R^ (1 - R1 (to)) exp (i ф2) =

” ._______ (7)

= J VR2(to) exp (iф2 )(1 - R1(to) )X о xg(to)r(to) f (to) exp (ito[t - А12 (р)])dto, где Eо (р, t) - поле изображения подложки в отсутствие объекта при полном отражении от её поверхности, E1 (р, t) и E2 (р, t) - волновые поля, отраженные границами слоя объекта, Аt1 (р) и А12 (р) - временные интервалы запаздывания волн, отраженных границами слоя, относительно волнового поля   Eо (р, t):

A t 1 = - 2 d ( p ) n 0 / c , A 1 ₂ = 2 d ( p )( n - n 0 )/ c , d ( p ) - геометрическая толщина слоя, g (ω) – амплитудный спектр излучения источника, т ( to ) - амплитудное спектральное пропускание оптического системы микроскопа, f (ω) – совместный амплитудный спектр чувствительности и пропускания фильтра фотодетектора.

Интенсивность изображения определяется операцией усреднения мгновенной интенсивности суммарного поля:

¹ (^Р) ~ (| ^Е 1 (^{P ,} t ) + ^E 2 (^Р , t )|²) =

= J R1(to)g 2(to)T2 (to) f2 (to) dto + to

+ J R ₂ ( to ) ( 1 - R 1 ( to ) ) ² g ² ( to ) T ² ( to ) f ² ( to ) d to +         (8)

to

+2 Re exp (i (Ф1 - ф2)) J ^Ri(to)R2(to) (1 - R (to)) x xg2(to)T2 (to) f2 (to)exp ito——Jdto где использовано фильтрующее действие дельтафункции 5(to-to') ~(exp(i(ю-to')t)).

Выражение (8) позволяет проводить моделирование интерференционного изображения, используя спектральные свойства источника света, оптических элементов микроскопа, объекта и фотодетектора.

3.    Формирование цветного интерференционного изображения

При моделировании полихроматических интерференционных картин необходимо учитывать особенности записи изображений матричными фотодетекторами (ПЗС, КМОП [28]) и численного представления цветных изображений. Для описания записи цветного изображения следует использовать формализованное понятие цвета и цветового пространства. Цвет каждого пиксела изображения задается определенным набором численных значений, которые называются цветовыми координатами представления цвета [29].

В данной работе использовалась цветовая модель RGB, применяемая в системах цифровой регистрации и визуализации цветных изображений. Модель RGB – аддитивная модель цвета, и RGB-изображение представляет собой трехмерный массив пикселов, структура которого представлена на рис. 3.

В системе RGB цветное изображение представляется набором матриц трех монохромных изображений – в красном, зеленом, синим цвете. Монохромные изображения называют цветовыми каналами или компонентами. Каждый из этих каналов представляет собой монохромное изображение в градациях серого. Число бит, используемых для представления величины цветного пикселя, определяет область значений цвета изображения. В данной работе использованы 8-битные изображения для цветовых компонент изображения, что в результате формирует RGB-изображение с глубиной цвета 24 бита.

Цветовые компоненты в системе RGB

R G

В

Синий Зеленый Красный

Рис. 3. Принцип формирования RGB-изображения

В цифровых системах записи цветных изображений перед матрицей фотодетекторов располагаются светофильтры, которые выделяют из всего спектра излучения определенные спектральные интервалы, а также ИК-фильтр, отрезающий ИК-излучение в области чувствительности фотодетекторов. Полноцветное изображение определяется суммой трех изображений, получаемых при прохождении полного светового поля через светофильтры цветовых каналов.

Таким образом, для моделирования цветного интерференционного изображения с использованием выражения (8) необходимо иметь три подобных выражения, в которых используются функции спектрального пропускания светофильтров, отвечающих за формирование каждой цветовой компоненты RGB-изображения: f_R ² ( to ), f_G ²( to ) и f_B ²( to ), спектральную функцию источника света g ²( to ), соответствующую белому свету, например, теплового источника, и спектральную функцию пропускания всей оптической системы микроскопа T ²( to ). Иными словами, необходимо рассчитать три числовые матрицы пространственного распределения интенсивности света I ( р ), каждая из которых представляет интерференционное изображение, образованное при прохождении интерферирующих полей через светофильтр, соответствующий основному цвету цветовой модели. Выражения для интерференционных изображений в цветовых каналах имеют следующий вид:

to

Ich (^р) = J ^R 1 ^{( to )} fch ^{2( to )} g ^{2( to )} T ² (^to) ^{d to +} 0

to

+J R2 (to) (1 - R1 (to) )2 fch2 (to)g2 (to)T2 ( to) dto + to

+ 2 Re exp ( i ( Ф 1 - Ф 2 ) )J^ R 1 ( to ) R 2 ( to ) ( 1 - R 1 ( to ) ) x

^A(^p )L d to c J

x g2(to)T2 (to) fch2 (to) exp I ito где индекс ch = R,G,B обозначает цветовой канал.

Выражения (9) позволяют рассчитать распределения интенсивностей монохромных интерференционных изображений в цветовых каналах и моделировать цветное интерференционное изображение в виде RGB-изображения.

4.    Моделирование цветных интерференционных изображений

Для расчетов и формирования интерференционных изображений мы использовали спектральные кривые чувствительности светофильтров fh2 (X) матричных фотодетекторов, используемых в микроскопах. На рис. 4 приведены кривые пропускания светофильтров (с учетом влияния ИК-фильтра) цифровой фотокамеры ToupCam UCMOS03100KPA микроскопа Микромед Полар-1, с помощью которого проводилось наблюдение и запись цветных интерференционных изображений слоистых микрообъектов.

На рис. 5 приведен совместный спектр излучения источника и пропускания оптической системы микроскопа g2(го)т2(го), определенный с помощью спектрометра OceanOptics USB2000 путем измерения спектра излучения непосредственно перед матричным фотодетектором при установке алюминиевого зеркала в предметной плоскости микроскопа.

На рис. 6 представлены интерференционные изображения тонкого клина с изменяющейся по линейному закону оптической толщиной z ( x ) = nd ( x ) = n α x , сформированные с использованием (9). Для упрощения коэффициенты отражения света гранями клина принимались равными R 1 = R 2 = 0,5 при ф 1 = ф 1 = п . Представлены интерференционные изображения цветовых каналов и результирующее цветное изображение.

Длина волны, нм

Рис. 4. Кривые пропускания красного R, зеленого G и синего B светофильтров матрицы фотокамеры ToupCam

Интенсивность, отн. ед. 1,0-

0,8

0.6-

0,4

0,2-

800 900 1000

Длина волны, нм

Рис. 5. Спектр оптического излучения, падающего на матрицу фотодетектора, при использовании в предметной плоскости микроскопа алюминиевого зеркала

Рис. 6. Интерференционные изображения тонкого клина в разных цветовых каналах и результирующее цветное интерференционное изображение

Разработанная модель позволяет представлять интерференционные изображения объектов с более сложным рельефом поверхности, оптической толщины. В качестве примера на рис. 7 приведены двумерные интерференционные изображения тонкого слоя с профилем оптической толщины z ( р ), определяемым выражением:

( z (x,У) = nz0 exp

2 y

(P y J.

а)

б)

в)

г)

д)

е)

Рис. 7. Двумерные цветные интерференционные изображения тонкого слоя с изменением оптической толщины в соответствии с уравнением (11) при n = 1,1, а = 2 и p x = 1,25, p y = да : а - z o = 125 нм, б - z o = 175 нм, в -z 0 = 250 нм, г – z 0 = 425 нм, д – z 0 = 525 нм, е – z 0 = 625 нм

На рис. 8 приведены трехмерные изображения объекта с осесимметричным профилем поверхности, определяемым (10), на поверхности которых наложена соответствующая профилю смоделированная цветная картина интерференционных полос.

Рис. 8. Трехмерные интерференционные изображения тонкого слоя с осесимметричным изменением оптической толщины в соответствии с уравнением (11) при n = 1,1, а = 2, px = py = 1,25 мкм: а - профиль центрального сечения поверхности слоя, б – г – трехмерные интерференционные изображения слоя с цветными интерференционными полосами: б – z0 = 0,25 мкм, в – 0,35 мкм, г – 0,63 мкм

5.    Определение толщины тонких пленок

Модель формирования полихроматической интерференционной картины можно использовать для определения оптических толщин объектов в виде тонких пленок по цвету их интерференционного изображения путем количественного сравнения цветов экспериментального и рассчитанного изображений. При моделировании изображения должны быть учтены частотный состав освещающего поля, спектральное пропускание оптической системы микроскопа, спектральные характеристики фильтров, чувствительность фотодетектора и др. Кроме этого, должны быть учтены оптические свойства самого объекта – априорные данные о комплексных коэффициентах отражения света границами объекта. Возможность оперирования при моделировании этими факторами в явном виде отражена в (9).

В качестве модельного объекта для формирования интерференционного изображения можно использовать тонкий клин с линейно изменяющейся оптической толщиной. Это обеспечивает возможность получения непрерывной зависимости цвета интерференционной картины от оптической толщины объекта во всем интервале оптических толщин, в котором формируется цветное интерференционное изображение в белом свете.

Алгоритм сравнения цветов интерференционных изображений – экспериментального и смоделированного, заключается в поиске совпадения значений цветов изображений, определяемого одновременным равенством интенсивностей цвета в каждом цветовом канале сравниваемых изображений. С математической точки зрения сравнение цветов изображений может состоять в определении близких к нулю разностей значений интенсивностей в каждом цветовом канале этих изображений:

δ Ich = Ich ( ∆ ) - Ic ^e h ^xp , (11)

где I ch ( ∆ ) – интенсивность рассчитанного изображения в цветовом канале ch при оптической толщине объекта Δ, I_c ^e _h ^xp – интенсивность экспериментального изображения в том же цветовом канале ch в выбранной области изображения объекта.

Обращение в ноль разности δ I ch соответствует равенству интенсивностей цветов смоделированного и экспериментального изображений в данном канале. Таким образом, задача сравнения цветов сводится к нахождению значений оптической толщины, при которой обращается в ноль разность δ I ch в соответствии с (11) одновременно для каждого цветового канала. В результате определяется оптическая толщина Δ в выбранной области объекта.

Этот метод определения толщины нами применялся для анализа толщин эритроцитов в мазке крови путем определения статистического распределения их толщин. В [30] представлены результаты измерений и показана работоспособность метода для решения задач медицинской диагностики.

На рис. 9 а приведено наблюдаемое в оптическом микроскопе интерференционное изображение группы эритроцитов в сухом мазке крови на подложке с высоким коэффициентом отражения – кремниевой пластине с полированной поверхностью [30].

Различие интерференционных цветов в изображениях эритроцитов указывает на вариации их толщин в мазке. На рис. 9б, в представлены эксперименталь- ное изображение отдельного эритроцита в мазке и изображение приблизительно того же цвета, смоделированного с использованием (9) и (10) при α = 10 ρx =4,5 мкм ρy =4,5 мкм и оптической толщине nz0 =0,6 мкм. Некоторое изменение толщины эритроцита в его пределах – клиновидность составила δ(nz) ≈ 0,02 мкм.

Рис. 9. Цветное интерференционное изображение группы эритроцитов в мазке крови на пластине кремния (а) и изображения одиночного эритроцита: экспериментально (б), смоделированное с приблизительно тем же интерференционным цветом и, соответственно, той же оптической толщиной, что и реальный эритроцит (в)

б)

в)

Обсуждение и заключение

Разработано теоретическое описание формирования и цифровой записи полихроматических интерференционных изображений слоистых объектов в микроскопии в белом свете. Данное описание важно не только с феноменологической точки зрения, но и как теоретическая основа метода измерения толщин тонких прозрачных слоев с использованием интерференции белого света. Интерференционный цвет изображения слоя определяется его оптической толщиной. Это дает возможность использовать разработанный алгоритм компьютерного формирования интерференционного изображения слоя для определения оптической толщины тонких слоев по цвету их интерференционного изображения.

Метод определения оптической толщины основан на количественном сравнении цвета интерференционного изображения, наблюдаемого в микроскопе, с цветом интерференционного изображения, получаемого расчетным путем для модельного объекта с задаваемой оптической толщиной и оптическими свойствами. Для этой цели удобно использовать модель оптического клина – тонкого слоя с меняющейся по известному закону оптической толщиной. В этом случае воспроизводится набор интерференционных цветов в определённом диапазоне оптических толщин, ограничиваемом длиной когерентности и шириной спектра используемого света. Обработка экспериментального изображения позволяет определить численные значения цвета в контролируемой области изображения. Для определения оптической толщины объекта интерференционный цвет в данной области сравнивается с моделируемой линейкой интерференционных цветов. По известной зависимости цвета от толщины определяется значение искомой оптической толщины объекта. Метод определения оптических толщин слоев по цветам их интерференционных изображений может быть использован в технике и в биомедицинских приложениях.

Цвет интерференционного изображения слоя также зависит от спектрального состава излучения источника, спектральных свойств оптических элементов микроскопа, отражения света границами слоя и его пропускания, от величины фазовых сдвигов волн при отражении от границ слоя, от спектральных свойств матричного фотодетектора, используемого для цифровой записи изображения. Влияние всех этих факторов заложено в теоретическую модель формирования цветного интерференционного изображения и может быть учтено при компьютерном формировании изображения.

Как показали наши предварительные исследования [31], еще одним фактором существенного влияния на интерференционный цвет изображения слоя служит ширина углового спектра, освещающего объект волнового поля, определяемая размерами апертурной диафрагмы осветительной системы и числовой апертурой объектива микроскопа. При достаточно широком угловом спектре освещающего слой поля разность фаз и взаимная когерентность волн, формирующих интерференционное изображение, начинают зависеть от ширины угловой апертуры поля [25], что проявляется и в цвете изображения слоя [31]. Поэтому дальнейшее развитие теоретической модели формирования в микроскопе цветных интерференционных изображений тонкослойных объектов должно учитывать влияние углового спектра освещающего объект волнового поля совместно с влиянием частотного спектра поля. Это позволит расширить функциональные возможности метода контроля оптических толщин слоистых микрообъектов путем использования для его реализации высокоразрешающих микроскопов с объективами с большой числовой апертурой и светосильной системой освещения.

Исследования выполнены за счёт гранта Российского научного фонда (проект №16-19-10528).