Определение остаточного количества антибиотиков в продуктах животного происхождения

Термин «антибиотики» охватывает широкий спектр химических веществ, которые производятся естественным, полусинтетиче-ским и синтетическим путем и используются для подавления (бактериостатического) роста бактерий или их уничтожения (бактерицидные). В зависимости от их действия они классифицируются как бактериостатические (бактерицидные), а также по серии эффективности как антибиотики узкого или широкого спектра действия [1].

В связи с широким использованием ветеринарных препаратов и антибиотиков в животноводстве одной из серьезных проблем обеспечения безопасности пищевых продуктов является наличие остаточных следов антибиотиков в продуктах животного происхождения. Данные препараты применяют для предотвращения быстрого распространения инфекционных заболеваний. Помимо лечебных и профилактических целей антибиотики могут использоваться в качестве кормовых добавок для увеличения массы тела и в качестве консервантов кормов [2, 3].

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License

Установлено, что при добавлении антибиотиков в корм происходит снижение падежа молодняка, ускорение процессов роста и развития и сокращение объема потребления кормов на 5– 10% [4]. Однако необходимо учитывать, что антибиотики попадая в организм животных способны длительное время циркулировать в нем, а их остатки попадают в продукты животного происхождения (молоко, мясо, яйца и др.). Также следы антибиотиков могут находится в сельскохозяйственных культурах и овощах из-за использования фекальных удобрений [2, 5, 6].

Остаточные следы антибиотиков могут вызывать различные побочные эффекты, такие как перенос устойчивых к антибиотикам бактерий человеку, иммунопатологические эффекты, аллергия, мутагенность, нефропатия (гентамицин), гепатотоксичность, репродуктивные расстройства, токсичность для костного мозга (хлорамфеникол) и даже канцерогенность (сульфаметазин, окситетрациклин), фуразолидон). Наиболее важным побочным эффектом остатков антибиотиков является перенос бактерий, устойчивых к антибиотикам, на человека благодаря мобильным свойствам устойчивости [7–9].

Цель работы – проведение анализа публикаций, в которых отражены последние разработки и достижения в области идентификации остаточных следов антибиотиков в пищевых продуктах.

Объекты и методы

Объектом исследования стала общедоступная научная литература, посвященная способам идентификации остаточного количества антибиотиков в продукиах животного происхожддения. Поиск научной литературы осуществлялся в следующих информационных базах данных: PubMed от National Center for Biotechnology Information (США), Scopus и ScienceDirect от Elsevier, на платформе Web of Science и в отечественной электронной библиотеке еLibrаrу.ru. Ограничениями поиска стал язык: русский и английский. Глубина поиска составила 5 лет. В рамках данной работы проведен аналитический обзор _ зарубежных и отечественных научных литературных источников.

Результаты

Амфениколы (хлорамфеникол, тиамфе-никол, и флорфеникол) – это антибактериальные препараты широкого спектра действия, бактериостатические с близкородственными химическими структурами.

Первое соединение в этом классе – хлорамфеникол выделено в 1947 г. из культуральной жидкости актиномицета Streptomyces venezuelae.

Он эффективен против многих патогенных бактерий, риккетсий и микоплазм и проявляет этот эффект, нарушая синтез белка у микроорганизмов [7]. Применение хлорамфеникола способствует возникновению многих побочных эффектов. Его используют при лечении смертельных инфекций, таких как холера, брюшной тиф и лихорадка. Хлорамфеникол используется для уничтожения вибрионов, особенно устойчивых к тетрациклину. По этой причине хлорамфеникол и антибиотики, производные тетрациклина, используются вместе в лечебных целях [11].

B. Vuran et al. для определения остаточного количества хлорамфеникола, разработали методику магнитной твердофазной экстракции (MSPE) в сочетании с методикой высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодной матрицей (HPLC-DAD). В качестве твердофазного сорбента были синтезированы магнитные наночастицы, покрытые нановолокном, и подробно охарактеризованы с использованием полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FE-SEM), рамановской спектроскопии и рентгеноструктурного анализа (XRD). Экспериментальные параметры метода были систематически исследованы и оптимизированы. Разработанный метод был применен к образцам настоящего молока для количественного определения остатков антибиотиков. Значения восстановления для хлорамфеникола были найдены в диапазоне 94,6–105,4% (n = 3) при использовании модельного раствора с добавками [12].

Метод определения хлорамфеникола как в прополисе, так и в пищевых добавках на основе прополиса был разработан J. Wen et al. с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (HPLC-MS/MS). Флавоны в образцах были удалены с помощью раствора ацетата свинца и аммиака, а жирорастворимые вещества, такие как пчелиный воск и растительные масла, были удалены с помощью n-гексан после растворения образца в этаноле. Трет-бутилметиловый эфир использовали в качестве растворителя для обратной экстракции для уменьшения соэкстракционных соединений, таких как полиэтиленгликоль 400 (PEG 400) и глицерин, которые являются обычными адъювантами пищевых добавок, и некоторых полярных помех. Хлорамфеникол обнаруживали с помощью ВЭЖХ-МС/МС и количественно определяли методом внутреннего стандарта. Калибровочная кривая показала хорошую линейность в диапазоне 0,20–50,0 мкг/л.

Пределы обнаружения и пределы количественного определения составили 0,03 и 0,1 мкг/кг соответственно. Извлечение в четырех различных матрицах на трех уровнях добавок находилось в диапазоне 86,0–114,4% с относительными стандартными отклонениями от 0,3% до 4,9%. Разработанный метод обладает преимуществами превосходной универсальности, простоты эксплуатации, высокой чувствительности и сильной защиты от помех [13].

Сульфаниламиды представляют собой класс синтетических антибактериальных препаратов, производные пара (π) – аминобензолсульфамида. Они способны быстро усваиваться, благодаря чему находят широкое применение в животноводстве в качестве лекарственных средств и стимуляторов роста. В последние годы остатки сульфаниламидов и их метаболитов постоянно попадают в почву и воду, создавая потенциальную опасность для окружающей среды.

В статье [14] синтезировали сферический мезопористый ковалентный органический каркас, как адсорбент твердофазной экстракции для сверхчувствительного определения сульфонамидов в образцах пищевых продуктов и воды методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Разработанный метод обеспечивает низкие пределы обнаружения (0,5–1,0 нг/л) и широкий диапазон измерения сульфаниламидов (5–1000 нг/л).

Тилозин – макролидный антибиотик широкого спектра действия, продуцируемый штаммов Streptomyces fradiae. Он относится к группе антибактериальных препаратов для лечения болезней бактериальной этиологии. Тилозин тартрат гранулят используется в качестве стимулятора роста (кормового антибиотика) для свиней, малого и крупного рогатого скота, и птиц. Остаточные следы тилозина способны вызывать аллергические реакции, нарушение кишечной микрофлоры и оказывать канцерогенное, мутагенное и гепатотоксичное воздействие [15].

Способ определение остатков тилозина в молоке с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) в сочетании с хемометрикой представлен в работе [16]. Авторы работы использовали инфракрасную спектроскопию с тпреобразова-нием Фурье с ослабленным полным отражением (ATR-FTIR), связанную с многослойной сетью перцептронов (MLP) и методом частичных наименьших квадратов (PLS). При анализе данных FTIR-спектров MLP позволяет распознать образцы молока, загрязненные тилозином, a PLS спрогнозировать очень низких концентраций (0,1–100 мкг/л) остатков тилозина

При совместной работе российских, болгарских и китайских ученых разработана двойная иммунохроматографическая тест-система для одновременного определения антибиотиков линкомицина и тилозина в пищевых продуктах. Иммунохроматографический анализ осуществлялся в непрямом конкурентном формате с использованием в качестве метки антивидовых антител, конъюгированных с наночастицами золота. При оптимальных условиях пределы обнаружения для тилозина и линкомицина составили 0,090 нг/мл и 0,008 нг/мл соответственно, а продолжительность анализа занимала 10 мин. Разработанная тест-система позволила определить остатки тилозина и линкомицина в молоке, меде и яйцах [17].

В статье [18] описан метод определения следов тилозина с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR). Авторы отмечают, что предложенная методика отличается высокой эффективностью, быстротой анализа и низкой стоимостью.

Тетрациклины относятся к недорогим антибиотикам широкого спектра действия в отношении грамположительных и грамотри-цательных бактерий, поэтому широко используются в медицине и ветеринарии. Однако в последнее время их остаточные следы в продуктах питания и окружающей среде вызывают серьезные опасения. В связи с этим разрабатываются различные методы идентификации и подготовки проб для анализа остатков тетрациклина в пищевых продуктах [22, 23].

Высокоселективный метод определения следов тетрациклина в пищевых продуктах представлен в статье [21]. Авторы статьи изготовили аптамер, закрепленный на тетраэдрических наноструктурно-функционализированных   маг нитных шариках ДНК (Apt-tet MB) в качестве зонда для обнаружения тетрациклина. В присутствии следов тетрациклина праймер ДНК высвобождается из Apt-tet MB, далее отделенный праймер ДНК вызывает реакцию амплификации по типу катящегося круга (RCA) и генерирует длинную тандемную одноцепочечную последовательность. Затем с помощью флуоресцентного красителя SYBR Green I сигнал флуоресценции фиксируется зондами обнаружения посредством гибридизации продукта RCA. Данный метод позволяет определить концентрацию тетрациклина в диапазоне от 0,001 до 10 нг/мл.

H. Sereshti et al. разработал метод электрохимически контролируемой твердофазной микроэкстракции на основе модифицированного медного электрода с проводящим нанокомпозитом полианилин / оксид графена для экстракции окситетрациклина, тетрациклина и доксициклина и дальнейшего их количественного определения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектором. При оптимальных условиях разработанный метод позволяет определить целевые аналиты в пределах обнаружения 0,32–1,01 и 2,42–7,59 мкг/л в пробах воды и молока соответственно [19].

В работе [20] предложили способ получения металлоорганических каркасов для дисперсионной твердофазной экстракции с целью определения следов тетрациклина в меде. Наиболее эффективной адсорбция-экстракция оказалась при комбинации MIL-101 (Cr), MIL-100 (Fe) и MIL-53 (Al) и соотношении компонентов 7:1:2. Данный метод позволял определить концентрацию окситетрациклина, тетрациклина, хлортетрациклина и доксициклин в диапазоне от 0,239 до 1,449 нг/г.

A. Kumar et al. предложили способ определения остаточных количеств окситетрациклина и амоксициллина в коровьем молоке с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором. Пределы обнаружения искомых аналитов составили 1,4 и 0,9 мкг/кг для окситетрациклина и 2,5 и 1,5 мкг/кг для амоксициллина [22].

Хинолоны представляют собой группу широко используемых синтетических антимикробных препаратов, также включающую фторхинолоны. За счет подавления бактериальных ферментов ДНК-гиразы, топоизомераз II и IV хинолоны оказывают угнетающее воздействие. Гибель клеток бактерий происходит за счет подавления ДНК-гиразы. Хинолоны часто используются в качестве первостепенных препаратов для лечения острых желудочнокишечных инфекций у людей, так как обладают высокой активностью против кишечных патогенов, а также в тех случаях, когда патоген, вызвавший заболевания еще не известен. Благодаря широкому спектру действия хинолоны также используются в ветеринарии. Однако было отмечено, что внедрение хинолонов в ветеринарную практику способствовало значительному росту устойчивости бактерий к антибиотикам данной группы.

Энрофлоксацин относится к группе фторхинолонов. Он эффективен против грам-положительных и грамотрицательных микроорганизмов и всех видов микоплазмы.

В работе [23] аргентинские ученые предложили метод определения остаточных следов энрофлоксацина в куриных яйцах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с быстросканиру-ющим флуоресцентным детектором.

Литовскими учеными разработан быстрый и надежный аналитический метод обнаружения хинолонов в мясе птицы с помощью масс-спектрометра ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием. Пробоподготовка образца была упрощена и сокращена до стадии экстракции и замораживания. Также был исключен этап хроматографического разделения и оптимизированы масс-спектрометрические параметры. В результате общее время анализа составляло менее одного часа. Разработанный метод позволяет определить наличие десяти хинолоновых соединений в мясе птицы в том числе ципрофлоксацина и энрофлоксацина [24].

Аминогликозиды представляют собой группу антибиотиков природного и полусинте-тического происхождения. Строение антибиотиков отличается присутствием аминосахара, соединённого гликозидной связью с аминоциклическим кольцом. Они обладают широким спектром действия и бактерицидной активностью против аэробных бактериальных инфекций. При накоплении в организме человека способны оказывать негативное воздействие и обладать ототоксичностью и нефротоксичностью. В связи с потенциальным риском для здоровья во многих странах установлены максимальные пределы содержания остаточных следов аминогликозидов в продуктах животного происхождения [25, 26].

Канамицин – аминогликозидный антибиотик, продуцируемый Streptomyces kanamyceticus или другими родственными микроорганизмами. Он широко используется для лечения грамположительных и грамот-рицательных бактериальных инфекций в медицине и ветеринарии. Механизм действия канамицина основан на взаимодействие с рибосомной РНК, препятствующей синтезу бактериального белка. Остаточные следы канамицин в избыточном количестве способны вызывать аллергические реакции, снижение слуха и оказывать нефротоксичность [26].

В работе [27] описан биосенсор на основе аптамеров для определения остатков канамицина в образцах сельскохозяйственной продукции. Он представляет из себя проточный аптамерный биосенсор, в котором изменения сигнала контролируются с помощью измерений поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на основе специфического взаимодействия аптамера с антибиотиком. Изменение сигнала пропорционально концентрации анализируемого вещества. Данный биосенсер позволяет определить концентрацию канамицина в диапазоне от 1 до 100 ммоль/л.

V. Yu et al. разработали высокочувствительный метод определения аминогликозидов в пищевых продуктах с помощью капиллярного электрофореза, ионизации и тандемной масс-спектрометрии с электрораспылением. Капиллярный электрофорез использовали для разделения аминогликозидов, а количественное определение проводили с помощью масс-спектрометрии. Предел обнаружения аминогликозидов составил 0,67 мкг/кг [25].

Y.R. Kim и H. – S Kang представили метод определения двадцати остатков аминогликозидов в продуктах животного происхождения с помощью жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии. Разделение проводили на колонке C 18 с обратной фазой и элюировали ацетонитрилом, содержащим ионнопарный реагент-гептафтормасляную кислоту. По сравнению с аналогами разработанный метод менее трудоемок и экономически выгоден из-за использования очистки d-SPE [26].

Полипептидные антибиотики – это группа противомикробных препаратов с широким спектром действия против многих грамотрицательных и грамположительных бактерий. Антибиотики данной группы обладают большой молекулярной массой и имеют общее структурное строение, состоящее из гептапептидного кольца с поли-пептидной боковой цепью.

В статье [28] описан метод ультра-высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии для идентификации остатков полипептидных антибиотиков (бацитрацина A, колистина A, колистина B, полимиксина В1 и полимиксина В2) в продуктах питания животного происхождения. Экстракцию проводили смесью ацетонитрила, воды и 25% раствора аммиака при объемном соотношении 80/10/10, далее проводили этапы выпаривания, восстановления и фильтрации. Хроматографическое разделение проводили на колонке С18 в режиме градиентного элюирования, а масс-спектральные измерения в режиме селективного мониторинга множественных реакций с помощью тройного квадрупольного масс-спектрометра. Данный метод позволяет определить концентрацию полипептидных антибиотиков в диапазоне от 10 до 1000 мкг/кг.

Колистин – антибиотик, продуцируемый некоторыми штаммами бактерии Paenibacillus polymyxa , оказывающий воздействие на большинство грамотрицательных бактерий. Токсичен для почек, отмечена также нейротоксичность,

Бацитрацин – антибиотик полипептидной группы, синтизируемый штаммами бактерии Bacillus subtilis . Действует на грамположительные микроорганизмы (бета-гемолитические стрептококки, стафилококки) и некоторых грамотри-цательные патогены. Механизм действия заключается в ингибировании синтеза клеточной оболочки бактерий [29].

В работе [31] представлен метод портативного иммуноферментного анализа с латеральным потоком для идентификации следов колистина и бацитрацина в молоке. Модификация метода заключалась в замене наночастиц золота, используемых в традиционном иммунофер-ментном анализе с латеральным потоком, флуоресцентными микросферами для маркировки моноклональных антител. Основываясь на принципе конкурентного связывания с меченными моноклональными антителами между аналитами в образцах и фиксированными антигенами на мембране. Предел обнаружения составил 100 и 50 нг/мл для бацитрацина и колистина соответственно.

H. Kumar et al. предложили способ определения колистина в яйцах и мясе птицы. Экстракцию колистина b проводили раствором подкисленного метанола и воды при соотношении 1:1, далее центрифугировали и фильтровали через мембранный фильтр. Анализ проводили с помощью ультра-высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрией. Предел количественного определения колистина разработанным методом составил для куриного мяса 10 мкг/кг, для яиц 5 мкг/кг. Данный метод является более экономически выгодным по сравнению с аналогами за счет снижения затрат на пробоподготовку [32].

В последние годы исследования ученых направлены на разработку методов, которые способны определять несколько классов антибиотиков одновременно. Так A. Mehl с соавторами разработали высокопроизводительный метод планарной твердофазной экстракции для быстрого скрининга 66 антибиотиков. Нажимая на различные участки изображения интерфейс аutоТLС-MS автоматически выделяет целевые зоны анализа непосредственно в масс-спектрометр высокого разрешения с орбитальной ловушкой, работающий в режиме сбора данных, не зависящего от переменных. В работе анализировалось наличие девяти различных классов антибиотиков (сульфонамиды, диаминопиримидины, линкозами-ды, плевромутилины, макролиды, цефалоспорины, пенициллины, амфениколы и нитроимидазолы). В качестве объектов исследования использовалась мышечная ткань, коровье молоко и куриные яйца. Продолжительность анализа составила 7 мин на образец, что в 5 раз быстрее, чем обычные современные технологии. Метод проверки одобрен для одного антибиотика каждого класса в соответствии с Решением Европейской комиссии 2002/657/EC. Авторы предполагают, что разработанный ими метод анализа обеспечит более полное исследование образцов и соответственно повысит безопасность пищевых продуктов [6].

Метод идентификации остаточных следов антибиотиков в козьем молоке представлен в работе [33]. В основе метода лежит экстракция на колонке РriМЕ HLB в сочинении с ультра-высокоэффективной жидкостной хроматографией и квадрупольной / электростатической полевой орбитальной масс-спектрометрией высокого разрешения. Разработанный метод позволяет определить одновременно до 62 ветеринарных антибиотиков. В оптимальных условиях предел количественного определения антибиотиков составил от 0,5 до 100 мкг/л.

Одновременное определение восьми ветеринарных препаратов и трех остатков метаболитов из четырех категорий (хлорамфениколы, нитроимидазолы, линкозамиды и макролиды) в яйцах, молоке, курице и пресноводной рыбы предложено в статье [34]. Разработанный метод основан на ультраэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии в сочетании с твердофазной экстракцией. Целевые аналиты разделяли на хроматографической колонке ACQUITY UPLC BEH С18 (100 мм x 2,1 мм, 1,7 мкм) при температуре колонки 40 °C и скорости потока 0,4 мл/мин. Объем инъекции составлял 10 мкл.

Градиентное элюирование проводили метанолом и 0,1% водным раствором муравьиной кислоты в качестве подвижных фаз. Разработанный метод обеспечивает низкие пределы обнаружения от 0,05 до 0,50 пг/кг и пределы количественного определения от 0,2 до 1,5 пг/кг.

Заключение

Во многих странах масштабы использования антибиотиков в сельском хозяйстве превышают их использование в медицине. Чрезмерное, неконтролируемое использование антибиотиков в ветеринарии в совокупности с несоблюдением правил приема препаратов, периодов отмены, а также строгого соблюдения правил безопасности пищевых продуктов представляет значительную угрозу для здоровья населения и экосистемы в целом. Помимо различных неблагоприятных последствий для здоровья, которые могут возникнуть в результате воздействия остаточных следов антибиотиков, антибиотикорезистентность микроорганизмов считается основной угрозой для здоровья человека в будущем.

Антибиотикорезистентность может передаваться людям через пищевые продукты, при непосредственном контакте с животным или через объекты окружающей среды. У антибиотикорезистентности нет экологических, географических, отраслевых или биологических границ. Так применение антибиотиков в одной стране или отрасли влияет на распространение антибиотикорезистентности в других странах и отраслях. Контроль и снижение негативного влияния остаточных следов антибиотиков на организм человека и окружающую среду является первоочередной задачей во всем мире. В соответствии со всем вышесказанным разработка методов идентификации остаточных следов антибиотиков в пищевых продуктах остается актуальной задачей и появляются все новые, более эффективные методы анализа.