Определение перестроек гена ALK в селектированной популяции российских больных немелкоклеточным раком легкого

Определение перестроек гена ALK у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) предложено в качестве обязательной процедуры большинством современных международных рекомендаций по диагностике и лечению онкологических заболеваний. Целью исследования было проведение тестирования методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) транслокаций с участием гена ALK у пациентов, направленных на тестирование мутаций гена EGFR в рамках Программы Общества онкологов-химиотерапевтов «Совершенствование молекулярно-генетическойдиагностикисцельюповышенияэффективностипротивоопухолевоголечения» Успешное тестирование проведено 189 из 200 больных НМРЛ без мутаций гена EGFR. Выявлено 12 позитивных случаев (6,3%). Показана зависимость частоты выявления реаранжировок гена ALK от гистологической формы опухоли, статуса курения и возраста пациента. Подтверждена эффективность использования метода FISH для широкого тестирования перестроек гена ALK в группе больных с железистыми гистологическими типами НМРЛ.

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является одним из наиболее пристально изучаемых онкологических заболеваний, что неудивительно, учитывая высокую частоту встречаемости этой патологии и более чем скромные успехи стандартной терапии [1]. Результаты исследований с применением современных методов молекулярной биологии позволили коренным образом изменить наши представления об особенностях возникновения разных форм этого заболевания и, соответственно, о тактике лечения и прогнозирования его течения. Стало совершенно очевидным, что с точки зрения генетической структуры опухоли, НМРЛ может быть разделен на принципиально разные группы, зависящие от ведущих этиологических факторов и типа онкогенеза. К наиболее интенсивно изучаемой группе относятся так называемые «невинные» раки, не связанные с курением, двигателями онкогенеза которых является довольно ограниченное количество генетических нарушений [2]. Типичным примером таких опухолей являются аденокарциномы, ассоциированные с аномалиями генов EGFR, ALK, ROS1, RET. Возможность лекарственного блокирования аберрантных фер-ментов-тирозинкиназ, кодируемых этими генами, позволяет в большинстве случаев добиться временного возврата опухолевых клеток к подобию нормального развития и, соответственно, их естественной гибели и выраженному уменьшению размера опухоли.

Доказанная в клинических исследованиях I и II фазы высокая эффективность кризотини-ба как сочетанного блокатора тирозинкиназ ALK, MET и ROS1 позволила провести процедуру ускоренной регистрации препарата для пациентов с перестройками гена ALK сначала в США, а затем и в остальных странах мира [3]. Более того, последние рекомендации по молекулярно-генетическому тестированию НМРЛ, разработанные Колледжем американских патологов (CAP), Международной ассоциацией по изучению рака легких (IASCL) и Ассоциацией молекулярной патологии (AMP), предлагают обязательное определение перестроек гена ALK при аденокарциноме легкого с диким типом гена EGFR [4]. Таким образом, систематическое направление больных НМРЛ для выявления реаранжировок гена ALK должно быть внедрено в ежедневную практику врача-онколога, так же, как и направление на определение мутаций гена EGFR.

Данное исследование стало первым пилотным проектом тестирования перестроек гена ALK у больных НМРЛ в рамках Программы Общества онкологов-химиотерапевтов «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики с целью повышения эффективности противоопухолевого лечения» www.

Основными задачами проекта стали определение частоты встречаемости реаранжировок ALK в группе пациентов, направляемых на исследование мутаций гена EGFR российскими онкологами, и изучение возможности массового проведения данного тестирования методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Материалы и методы

В исследование были включены 200 пациентов с НМРЛ, направленных на определение мутаций гена EGFR в рамках проекта www. с мая по сентябрь 2013 года. Основным критерием отбора пациентов было отсутствие мутаций EGFR, другие критерии (гистологический тип НМРЛ, пол, возраст, статус курения) не учитывались. В качестве материала для исследования присылался биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, окрашенные и неокрашенные цитологические препараты, плевральный выпот, окрашенные гистологические препараты. Исследование проводилось только в случае наличия опухолевых клеток в образце в достаточном количестве (не менее 50 в препарате), подтвержденном квалифицированным патоморфологом или цитологом.

В качестве метода исследования проводилась FISH с использованием Vysis LSI ALK Break Apart Rearrangement Probe Kit (Abbott Molecular, США) по методике, предложенной производителем. Основные этапы методики несколько отличались для разного материала. Из препаратов, фиксированных в формалине и залитых в парафин, приготавливались гистологические срезы толщиной 3-4 микрона, которые подвергались выдержке в термостате при температуре 56 ° С, дальнейшей депарафинизации и предварительной обработке раствором тиоцианата натрия. Цитологические препараты при необходимости отмывались от окрашивающего состава и выдерживались в фиксирующем растворе. Из плеврального выпота приготавливался клеточный осадок в фиксирующем растворе. Далее проводилась обработка материала протеазой и проведение гибридизации с флуоресцентным зондом в программируемом термостате Dako (Dako, Дания) или Thermobrite (Abbott Molecular, США) в температурном режиме, рекомендуемом производителем. По завершении гибридизации проводилась отмывка несвязавшейся пробы и окрашивание препаратов 4’,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации ядер клеток. Просмотр готовых препаратов и оценка результатов гибридизации приводились с использованием флуоресцентного микроскопа Axioimager A2 (Karl Zeiss, Германия), изображение фиксировалось при помощи программы ISIS (Metasystems, Германия). Гибридизация считалась успешной в тех случаях, когда ядра не менее чем 80% опухолевых клеток имели непрерывные границы, уровень аутофлуоресценции позволял отчетливо различать зеленые флуоресцентные сигналы, внутри ядер выявлялись четкие сигналы красного, зеленого или желтого цветов. Для оценки результатов подсчета использовались критерии, предложенные группой экспертов Европейского общества патологов (ESP) в 2012 г. [5]. Подсчитывались сигналы не менее чем в 50 ядрах опухолевых клеток в 4 зонах

Определение перестроек гена ALK в селектированной популяции российских больных немелкоклеточным раком легкого опухоли. Перестройка гена ALK считалась доказанной, если более чем в 15% ядер, кроме одного и более слитных сигналов, соответствующих неперестроенной 2 хромосоме, выявлялось расхождение красного и зеленого сигналов на расстояние, соответствующее двойному размеру наибольшего (красного) сигнала и подтверждающее произошедшую реаранжировку гена. Кроме того, перестроенными считались случаи, когда, кроме одного и более слитных сигналов, в ядрах выявлялись один и более одиночных красных сигналов. Такой тип распределения сигналов встречается при сочетании транслокации и частичной делеции гена ALK. В тех случаях, когда количество ядер опухолевых клеток с признаками перестройки сигнала составляло более 15%, но менее 50%, согласно рекомендациям ESP, препарат обязательно просматривался вторым специалистом.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием метода вычисления критерия χ 2 Пирсона или точного критерия Фишера путем анализа таблиц сопряженности с вычислением статистик связи.

Результаты

Провести анализ удалось в 189 случаях из 200, взятых в исследование (94,5%). Демографические и клинические характеристики больных представлены в таблице 1.

В 11 случаях гибридизация флуоресцентной пробы не была удачной. Причинами неудачи были нарушения обработки препарата на преаналитическом этапе. Выявлялись признаки либо избыточно длительной фиксации (возможно в кислом формалине), приводящей к повреждению ДНК за счет образования устойчивых нековалентных связей и дезаминации, либо слишком короткой фиксации, ведущей к образованию неравномерных коагулятов, содержащих протеины и ДНК, и продолжающемуся аутолизу внутри препарата [6;7].

Наиболее частым генетическим событием, обнаруженным при просмотре препаратов, было увеличение копийности гена ALK (от 3 до 15 копий, в среднем — 6 копий на клетку). Зависимости увеличения копийности от гистологического типа НМРЛ и статуса курения пациентов выявлено не было.

Таблица 1. Характеристика всей группы обследованных пациентов

Всего в группе из 189 больных, которым удалось выполнить анализ, было выявлено 12 пациентов с перестройкой гена ALK (6,3%). Среднее количество клеток с признаками перестройки составило 62,4% (41–90%). Более чем в половине случаев (7 из 12), определялась реаранжировка с частичной делецией гена, на что указывала потеря зеленого сигнала на перестроенной хромосоме. Увеличение ко-пийности как нормальной, так и перестроенной хромосомы обнаруживалось в 5 образцах. Клинические, демографические и генетические характеристики всех пациентов с реаранжировкой гена ALK представлены в таблице № 2. В остальных 179 случаях количество клеток с раздельно лежащими сигналами не пре-

Таблица 2. Характеристика пациентов с перестройками гена ALK