Определение степени дисфункции нейтрофилов периферической крови у пациентов с механической желтухой

Пахомова Р.А.; Петрушко С.И.; Кочетова Л.В.; Назарьянц Ю.А.; Волков Ю.М.; Маркелова Н.М.; Pakhomova R.A.; Petrushko S.I.; Kochetova L.V.; Nazariants Yu.A.; Volkov Yu.M.; Markelova N.M.

doi:10.17238/2072-3180-2026-1-24-31

Научные статьи \ Прикладные науки. Медицина. Технология \ Mедицинские науки \ Патология. Клиническая медицина \ Заболевания пищеварительной системы. Болезнь пищеварительного тракта

Определение степени дисфункции нейтрофилов периферической крови у пациентов с механической желтухой

Автор: Пахомова Р.А., Петрушко С.И., Кочетова Л.В., Назарьянц Ю.А., Волков Ю.М., Маркелова Н.М.

Журнал: Московский хирургический журнал @mossj

Рубрика: Абдоминальная хирургия

Статья в выпуске: 1 (95), 2026 года.

Бесплатный доступ

Введение. Механическая желтуха (МЖ) – наиболее тяжелое осложнение петологии гепато-панкреато-дуоденальной зоны. Несмотря на улучшение результатов вследствие использования малоинвазивной хирургии, уровень летальности остается высоким. Цель. Изучить состояние нейтрофильных гранулоцитов методом атомно-силовой микроскопии у пациентов с механической желтухой доброкачественного генеза разной степени тяжести. Материалы и методы. В полицентровое исследование были включены 84 пациента в возрасте от 41 до 64 лет, проходивших лечение в стационарах г. Красноярска с диагнозом механической желтухи доброкачественного генеза. Контрольную группу составили 60 доноров. Все пациенты рапределены на 3 группы по степени тяжести механической желтухи. Проводилось исследование хемилюминесценции нейтрофилов и атомно-силовая микроскопия нейтрофильных гранулоцитов с определением формы, состояния мембраны, сил адгезии. Результаты. У пациентов с механической желтухой интенсивность спонтанной хемилюминесценции зависит от степени тяжести механической желтухи. При атомно-силовой микроскопии выявлены нарушения структурной организации нейтрофильного гранулоцита. С увеличением степени тяжести механической желтухи нейтрофил приобретал выпуклую форму, увеличивалось количество сегментов ядра, мембрана клетки становилась неровной. Величина сил адгезии нейтрофилов падала от 25 % до 31 %. Обсуждение. На основании анализа хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов крови можно заключить, что функциональные возможности клеток у больных МЖ истощаются параллельно нарастанию степени тяжести МЖ. Это сопровождается изменениями самого нейтрофила. Заключение. По мере утяжеления степени механической желтухи доброкачественного генеза в периферической крови происходит уменьшение количества нейтрофильных лейкоцитов и увеличение количества лимфоцитов. Интенсивность спонтанной хемилюминесценции также зависит от степени тяжести МЖ, и соответственно, уменьшается по мере утяжеления степени желтухи, что приводит истощению функциональных возможностей нейтрофилов. Этот процесс усугубляется изменениями формы нейтрофила и его мембраны. В совокупности это вызывает снижение иммунного ответа организма и утяжеляет течение заболевания.

Еще

Механическая желтуха, хемилюминесцентный ответ, атомно-силовая микроскопия, нейтрофил

Короткий адрес: https://sciup.org/142247236

IDR: 142247236 | УДК: 616.36-008.5 | DOI: 10.17238/2072-3180-2026-1-24-31

Determination of the degree of peripheral blood neutrophil dysfunction in patients with obstructive jaundice

Introduction. Mechanical jaundice (MF) is the most severe complication of the pathology of the hepato-pancreato-duodenal zone. Despite the improvement in results due to the use of minimally invasive surgery, the mortality rate remains high. Goal. To study the state of neutrophilic granulocytes by atomic force microscopy in patients with benign obstructive jaundice of varying severity. Materials and methods. The polycentric study included 84 patients aged 41 to 64 years who were treated in hospitals in Krasnoyarsk with a diagnosis of obstructive jaundice of benign origin. The control group consisted of 60 donors. All patients were divided into 3 groups according to the severity of obstructive jaundice. The chemiluminescence of neutrophils and atomic force microscopy of neutrophil granulocytes were studied to determine the shape, state of the membrane, and adhesion forces. Results. In patients with mechanical jaundice, the intensity of spontaneous chemiluminescence depends on the severity of mechanical jaundice. Atomic force microscopy revealed violations of the structural organization of the neutrophil granulocyte. As the severity of mechanical jaundice increased, the neutrophil acquired a convex shape, the number of nuclear segments increased, and the cell membrane became uneven. The magnitude of neutrophil adhesion forces decreased from 25 % to 31 %. Discussion. Based on the analysis of the chemiluminescent activity of neutrophilic blood granulocytes, it can be concluded that the functional capabilities of cells in patients with breast cancer are depleted in parallel with an increase in the severity of breast cancer. This is accompanied by changes in the neutrophil itself. Conclusion. As the degree of benign obstructive jaundice worsens, the number of neutrophilic leukocytes in the peripheral blood decreases and the number of lymphocytes increases. The intensity of spontaneous chemiluminescence also depends on the severity of breast cancer, and, accordingly, decreases as the degree of jaundice increases, which leads to depletion of the functional capabilities of neutrophils. This process is aggravated by changes in the shape of the neutrophil and its membrane. Together, this causes a decrease in the body's immune response and worsens the course of the disease.

Еще

Текст научной статьи Определение степени дисфункции нейтрофилов периферической крови у пациентов с механической желтухой

Механическая желтуха (МЖ) – наиболее тяжелое осложнение петологии гепато-панкреато-дуоденальной зоны. Несмотря на улучшение результатов вследствие использования малоинвазивной хирургии, уровень летальности остается высоким (от 4,7 до 24,5 %) [1, 2].

Повышение давления в холедохе до 300 мм вод. ст. вызывает развитие системной интоксикации, которая нарушает функционирование иммунной системы [3, 4].

К тому же операция, наркоз и применение ряда медикаментов снижают фагоцитарную активности клеток и вызывают вторичный иммунодефицит [2, 4]. Это проявляется в угнетении активности лейкоцитов и подавлении секреторной функции [3, 5, 6, 7]. Уменьшение фагоцитарной активности не только сохраняется в после проведенной декомпрессии, но и усиливается.

Противоречивость научных данных, недостаточное количество исследований гомеостаза при механической желтухе предрасполагает дальнейшее изучение данной патологии.

Цель. Изучить состояние нейтрофильных гранулоцитов методом атомно-силовой микроскопии у пациентов с механической желтухой доброкачественного генеза разной степени тяжести.

Материал и методы

В полицентровое исследование были включены 84 пациента в возрасте от 41 до 64 лет, проходивших лечение в стационарах г. Красноярска с диагнозом механической желтухи доброкачественного генеза. В протокол диагностического обследования в обязательном порядке входили лабораторные исследования, УЗИ органов брюшной полости, рентгеноконтрастные исследования желчных путей и желчного пузыря, эндоскопических методов.

Все пациенты дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

При проведении исследования соблюдались рекомендации, этические нормы и принципы, установленные в Декларации (Хельсинки, 1964 г.), регламентирующей научные исследования на человеке.

Степень тяжести МЖ определяли по классификации Э.И. Гальперина (2012 г.). В 1 группу включен 31 пациент с тяжестью МЖ класса А, средний возраст которых составил 61,2±8,1 года (M±σ), во 2 группу – 26 пациента с тяжестью МЖ класса В, средний возраст которых был 60,9±7,4 года (M±σ), в 3 группу – 27 пациентов со средним возрастом 62,3±7,6 года (M±σ) и степенью тяжести МЖ класса С. Группы сопоставимы по половой принадлежности пациентов. Контрольную группу составили 60 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой.

Кроме клинического анализа крови для оценки степени интоксикации и состояния резистентности определяли лю-минол-зависимую хемилюми-несценцию (ХЛ) нейтрофилов периферической крови по методу De Sole al. [8]. При исследовании спонтанной и индуцированной ХЛ анализировали максимальное значение интенсивности ХЛ (I max), время выхода на максимум интенсивности (T max) и площадь кривой ХЛ (S).

На атомно-силовом микроскопе Integra Aura (NT-MDT, Россия) (АСМ) изучены структурно-функциональные свойства нейтрофильных гранулоцитов. Сканирование поверхности образцов проводили в полуконтактном, а при измерении сил адгезии – в контактном режиме на воздухе.

Для анализа сканов использовали метод мазка крови, на котором выбирались отдельные нейтрофилы. Каждая исследуемая клетка была просканирована дважды: первый раз клетка целиком, второй раз – мембрана клетки для анализа ее состояния.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft, USA). Характер распределения изучаемых признаков определялся при помощи критерия Шапиро-Уилка. Описательная статистика представлена средними арифметическими, стандартными отклонениями (при нормальном распределении) и медианой, и квартилями (при распределениях, отличающихся от нормального). Статистическую значимость различий между показателями нормально распределенных независимых выборок при условии множественных сравнений оценивали при помощи дисперсионного анализа с последующими парными сравнениями групп по критерию Шеффе, в случаях отсутствия нормального распределения использовали критерий Краскела-Уоллиса и парные сравнения по критерию Манна-Уитни. В результате статистически значимым уровнем различий при сравнении 3 групп считали p<0,017, при сравнении 4 групп – р<0,008.

Результаты

По данным клинического анализа крови (табл. 1) показали, что у пациентов 2 группы количество нейтрофилов было больше, а лимфоцитов и моноцитов меньше по сравнению с пациентами 1 группы (р <0,05). У пациентов группы 3 количество нейтрофилов было меньше, а лимфоцитов больше, чем у больных групп 1 и 2. Различия в количестве эозинофилов и базофилов у пациентов групп 1 и 2 статистически незначимы, а у пациентов 3 группы количество эозинофилов статистически значимо больше, количество базофилов по сравнению с контрольной группой и пациентами 1 группы оставалось на прежнем уровне на фоне статистически значимо меньшего количества нейтрофилов по сравнению с первой и второй группами.

Таблица 1

Состояние клеточного звена иммунитета у больных механической желтухой по группам

The state of cellular immunity in patients with obstructive jaundice by groups

Table 1

Показатели/ Indicators	Контроль/ Control		Группа 1/ Group 1		Группа 2/Group 2		Группа 3 /Group 3
	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75
Лейкоциты, (10⁹/л)/ White blood cells (10⁹/l)	5,7	4,82–7,47	6,8	6,05–7	9,95	8,32–10,95	14,5	12,88–17,33
							Р_4-1<0,05
Лимфоциты, (%)/ Lymphocytes, (%)	38,2	32,2–4,9	12,3	11,65 – 13,7	26,3	22,93-32,6	18,05	13,05-20,85
			Р_2-1<0,05		Р_3-2<0,05
Лимфоциты, (10⁹/л)/ Lymphocytes (10⁹/l)	2,05	1,52–3,44	0,748	0,7–0,92	2,5	2,07–3,59	2,46	2,07–3,26
			Р_2-1<0,05
CD3⁺, (%)	66	60,0 – 72,0	34,06	34,03 – 35,03	20	10–41,02	18	12–27
					Р_3-1<0,05		Р_4-1<0,05
CD3+, (10⁹/л)	1,19	0,94–2,46	0,27	0,25-0,32	0,74	0,21-1,43	0,39	0,25-0,7
			Р_2-1<0,05		Р_3-2<0,05		Р_4-1<0,05
CD4⁺, (%)	45,0	34,0 – 48,75	40	34,65–44	16	11,77–29,74	12	6–28
					Р_3-1<0,05 Р_3-2<0,05		Р_4-1<0,05 Р_4-2<0,05

Окончание Таблицы 1 / End of Table 1

Показатели/ Indicators	Контроль/ Control		Группа 1/ Group 1		Группа 2/Group 2		Группа 3 /Group 3
Показатели/ Indicators	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75
CD4⁺, (10⁹/л)	0,70	0,50– 1,76	0,3	0,25–0,41	0,67	0,31–1,09	0,31	0,16–0,64
CD4⁺, (10⁹/л)			Р_2-1<0,05		Р_3-1<0,05		Р_4-1<0,05 Р_4-3<0,05
CD8⁺, (%)	27,0	20,0 – 33,75	27,41	22,7–29,93	16	10–25,46	13	6–26,75
CD8⁺, (%)							Р_4-1<0,05 Р_4-2<0,05
CD8⁺, (10⁹/л)	0,50	0,30 – 1,11	0,21	0,17–0,25	0,53	0,31–0,82	0,27	0,15–0,55
CD8⁺, (10⁹/л)			Р_2-1<0,05		Р_3-2<0,05
CD16⁺, (%)	20,0	17,0 – 23,0	36	28,87–35,57	10	6–22	13	6–23,96
CD16⁺, (%)					Р_3-2<0,05		Р_4-2<0,05
CD16⁺, (10⁹/л)	0,38	0,26 – 0,85	0,27	0,25–0,45	0,24	0,13–0,44	0,32	0,13–0,54
CD19⁺, (%)	13,5	9,0 – 15,75	30	28,87–35,57	14,07	6–30	14	5,5–29,08
CD19⁺, (%)			Р_2-1<0,05
CD19⁺, (10⁹/л)	0,25	0,15–0,57	0,22	0,2–0,34	0,35	0,14–0,61	0,31	0,19-0,77
CD25⁺, (%)	22	14–32,03	31	30,5–40,86	6	2–16	8	6–19
CD25⁺, (%)					Р_3-1<0,05 Р_3-2<0,05		Р_4-1<0,05 Р_4-2<0,05
CD25⁺, (10⁹/л)	0,45	0,21–1,10	0,22	0,21–0,39	0,19	0,07-0,4	0,23	0,13–0,41
CD72⁺, (%)	27	15,6–34,2	52	37,14–54,8	16	2–20	8	2,25–15
CD72⁺, (%)					Р_3-2<0,05		Р_4-1<0,05 Р_4-2<0,05
CD72⁺, (10⁹/л)	0,55	0,24–1,17	0,39	0,27–0,51	0,33	0,08–0,38	0,19	0,07–0,33
CD72⁺, (10⁹/л)							Р_4-1<0,05 Р_4-2<0,05
CD95⁺, (%)	8,01	6,3–10,1	10,63	7,31–14,31	10	4–20	8	4–10
CD95⁺, (10⁹/л)	0,16	0,096–0,34	0,07	0,06–0,1	0,2	0,03–0,34	0,2	0,07–0,28
HLA-DR⁺, (%)	15,00	12,00 – 20,00	4	4–7,5	2	2–10	4	2–7,05
HLA-DR⁺, (%)			Р_2-1<0,05		Р_3-1<0,05		Р_4-1<0,05
HLA-DR⁺, (10⁹/л)	0,26	0,17–0,68	0,04	0,036–0,057	0,08	0,05–0,2	0,09	0,04–0,18
HLA-DR⁺, (10⁹/л)			Р_2-1<0,05		Р_3-1<0,05		Р_4-1<0,05

Показатели хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов представлены в таблице 2.

При исследовании хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов крови у пациентов 1 и 2 группы, по сравнению с контрольной обнаружено стати- стически значимое повышение максимума интенсивности (р≤0,001) и площади спонтанной ХЛ (р≤0,001). Кроме того, у пациентов этой группы имелась тенденция к замедлению времени выхода на максимум (р≤0,001) спонтанной хемилюминесценции.

Таблица 2

Хемилюминесцентная активность нейтрофилов в норме у больных 1–3 групп

Chemiluminescent activity of neutrophils is normal in patients of groups 1–3

Table 2

Показатели/ indicators	Контроль/ Control		1 группа/ group 1		2 группа/ group 2		3 группа/group 3
Показатели/ indicators	Ме	^С25–^С75	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75	Ме	^С25^-С75
Tmax спонтанная/ spontaneous, (с)	975	211–1510	1583	1476–1933	1569	1096–2448	1694	1062-2273
Imax спонтанная/ spontaneous	7720	3000–19000	46029	26884–65174	13922	6118–19925	15302	7711-29712
Imax спонтанная/ spontaneous			Р_2-1<0,05				Р_4-2<0,05
Squr спонтанная / spontaneous (*10⁶)	0,22	0,15–0,54	1,54	0,77–9,77	2,16	1,14–3,79	2,81	1,67-5,59
Squr спонтанная / spontaneous (*10⁶)			Р_2-1<0,05		Р_3-1<0,05		Р_4-1<0,05
Tmax индуцированная/ induced, (с)	1102,5	872–1800	2312	1918–3761	1448	1123–1949	1684	1032-2579
Tmax индуцированная/ induced, (с)			Р_2-1<0,05
Imax индуцированная/ induced	17270	8000–42840	11038	8698–46947	22257	6703–31124	30090	21449-47302
Squr индуцированная/ induced, (*10⁶)	0,4	0,15–0,95	2,26	1,78–12,98	4,5	1,36–7,55	5,33	4,04-8,43
Squr индуцированная/ induced, (*10⁶)			Р_2-1<0,05		Р_3-1<0,05		Р_4-1<0,05 Р_4-2<0,05
Индекс активации/ Activation index	1,3	0,9–2,0	1,39	1,35–1,43	1,88	1,41–2,27	1,48	1,25-2,99

При оценке показателей спонтанной ХЛ нейтрофильных гранулоцитов крови у пациентов 3 группы регистрировалось статистически значимое увеличение площади под кривой ХЛ (р≤0,001) по сравнению с величинами нормы. Кроме того, обнаружено снижение максимума интенсивности относительно показателей, зарегистрированных у пациентов 1 группы (р≤0,001).

Для исследования цитоархитектоники нейтрофилов использовали метод атомно-силовой микроскопии.

При сканировании на АСМ получены изображения отдельно лежащих нейтрофилов. Было проведено определение площади и объема нейтрофила. Величина площади не зависит от степени тяжести МЖ (табл. 3), однако объем статистически значимо уменьшается у пациентов 2 группы и увеличивается у больных 3 группы. Для исследования функциональных особенностей нейтрофилов были изучены их адгезионные свойства. У каждого пациента из пробы было выделено по 10 нейтрофилов, на каждом нейтрофиле было проведено 15 измерений сил адгезии: по пять измерений на трех различных линиях. Величина силы адгезии у пациентов с МЖ 1 группы была меньше на 25 % по сравнению с контрольной группой и продолжала уменьшаться по мере нарастания уровня билирубина (табл. 3).

Таблица 3

Хемилюминесцентная активность нейтрофилов в норме у больных 1–3 групп

Table 3

Chemiluminescent activity of neutrophils is normal in patients of groups 1–3

	S, мкм² (М±σ)	V, мкм³ (М±σ)	F, нН (М±σ)
Норма/Standard	129,21±9,23	51,00±5,00	1,04±0,03
Группа 1/ Group 1	126,51±4,15	50,38±2,90	0,81±0,01
Группа 2/ Group 2	118,88±7,42	45,32±3,28	0,77±0,01
Группа 3/ Group 3	127,18±4,72	62,20±5,94	0,76±0,01

Примечание: S – площадь, V – объем, F – сила адгезии

Вышеизложенное может говорить о том, что концентрация содержания билирубина в крови снижает силы адгезии зондов к поверхностям нейтрофилов и, как следствие, влияет на адгезионные свойства нейтрофилов в целом, причем это влияние наиболее выражено на ранних стадиях повышения содержания билирубина в крови.

В контрольной группе нейтрофилы были округлой формой и четко сегментированным ядром. В зависимости от тяжести МЖ нейтрофил приобретает выпуклую форму, количество сегментов ядра уменьшается, они становятся размытыми, мембрана клетки – неровной. На мембране появляется большое количество пор со средними ориентированными значениями диаметров и глубин, равными 500 и 300 нм (рис. 1).

Рис. 1. Мембрана нейтрофила в норме и при механической желтухе (1–3 группы)

Fig. 1 . Neutrophil membrane in normal and obstructive jaundice (groups 1–3)

Обсуждение

Количество пациентов с механической желтухой доброкачественного генеза неуклонно возрастает. Одной из причин смерти является печеночная недостаточность, возникающая как следствие эндогенной интоксикации и вторичной иммунной недостаточности. В связи с этим необходимо оценить патогенез иммунной дисфункции при холестазе. Ключевым звеном в формировании иммунных реакций является нейтрофильный лейкоцит [9, 10]. Следовательно изучение изменений функционально-метаболической активности нейтрофилов и строения их цитоскелета имеет важное научно-практическое значение.

Нейтрофильные гранулоциты принимают активное участие в формировании воспалительного ответа [4–9]. Данные, полученные в представленном исследовании, свидетельствуют о выраженных изменениях кинетики ХЛ-ответа нейтрофилов периферической крови. При сравнительном анализе, проведенном в работе выявлена корреляция интенсивности ХЛ-ответа нейтрофильных гранулоцитов с тяжестью течения МЖ.

На основании анализа хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов крови можно заключить, что функциональные возможности клеток у больных МЖ истощаются параллельно нарастанию степени тяжести МЖ.

Это сопровождается изменениями самого нейтрофила. При атомно-силовой микроскопии отмечено изменением формы и объема лейкоцита, истончение мембраны, увеличение количества пор.

По данным исследования выявлено снижение значений сил адгезии по мере увеличения степени тяжести заболевания. Снижение силы адгезии зонда к поверхности нейтрофилов отражает снижение способности нейтрофилов вступать в межклеточные контакты, что при водит к нарушению хемотаксиса и фагоцитоза.

Заключение

По мере утяжеления степени механической желтухи доброкачественного генеза в периферической крови происходит уменьшение количества нейтрофильных лейкоцитов и увеличение количества лимфоцитов. Интенсивность спонтанной хемилюминесценции также зависит от степени тяжести МЖ, и соответственно, уменьшается по мере утяжеления степени желтухи, что приводит истощению функциональных возможностей нейтрофилов. Этот процесс усугубляется изменениями формы нейтрофила и его мембраны. В совокупности это вызывает снижение иммунного ответа организма и утяжеляет течение заболевания.