Определение стимулирующего и токсического воздействия нанопорошков меди и кобальта на проростки риса

Нанотехнологии получают бурное развитие, и их влияние на развитие экономики, повышение качества жизни – несомненно. Помимо использования ультрадисперсных порошков (УДП) металлов в качестве новых конструкционных материалов и катализаторов, возрос интерес к применению их в сельском хозяйстве, животноводстве, медицине. По утверждению экспертов, основанному на проведенных за несколько лет исследованиях, нанотехнологии обладают огромным потенциалом. Они меняют взгляд на использование стимуляторов роста растений, подавление патогенной микрофлоры растений и животных, процессы заживления и восстановления [1; 8; 9; 12]. Определены основные направления применения нанопорошков в растениеводстве. Предпосевная обработка семян рапса, вики, свеклы, пшеницы, огурцов, кукурузы, хлопчатника, картофеля, диспергированной суспензией УДП железа повышает урожайность этих культур по сравнению с контрольными образцами. Определение состава питательных веществ в растениях, выращенных из обработанных семян, показывает качественные изменения, в частности, улучшение аминокислотного состава [10].

Многолетние исследования подтверждают высокую биологическую и физиологическую активность нанопорошков [6]. Частицы металлов в ультрадисперсном состоянии способны проникать через клеточные мембраны, принимать участие в окислительно-восстановительных реакциях, изменять содержание микроэлементов [5]. Металлы в ультрадисперсном состоянии пролонгиро-ванно воздействуют на минеральное питание, углеводный и азотный обмен, синтез аминокислот, реакции фотосинтеза и дыхания [4].

До недавнего времени интенсивная агрономия предполагала внесение в почву минеральных солей в качестве удобрений. Образующиеся в результате этого в почве анионы солей оказывают негативное воздействие на почвенный состав вследствие их увеличения в составе растений, что в конечном итоге неблагоприятно для потребителей. В этом случае использование УДП для микро-элементного воздействия на растения исключает отрицательное влияние различных анионов. Кроме того, токсичность солей оказалась в 4–10 раз выше токсичности чистых металлов [8].

Научные достижения позволяют детально изучить воздействие наночастиц на качество сельхозпродукции, воды и в целом на среду обитания и здоровье человека. Это связано с малой величиной частиц ультрадисперсных металлов, их способностью проникать в ткани и клетки и вступать в химические взаимодействия. В связи с увеличением коммерческих продуктов при производстве которых используются наноструктурные материалы, оценка токсичности наноматериа- лов должна получать больше внимания, чем когда-либо прежде, встает вопрос поиска способа обнаружения наноразмерных систем, особенно широко используемых в промышленности.

Целью наших исследований является изучение влияния нанокристаллических порошков меди и кобальта на морфофизиологические и биометрические показатели проростков риса, а также изучение их токсического воздействия на исследуемое растение.

Материалы и методы исследования

Биологическая активность нанопорошков металлов зависит от различных факторов: способа их получения, размера частиц, концентрации раствора. Используемые в нашей работе нанопорошки кобальта и меди получены методом химического осаждения гидроксидов металлов с последующим низкотемпературным восстановлением их в токе водорода. Средний размер частиц составил 30–50 нм.

Катионы, образуемые железом, кобальтом, медью, входят в состав карбоксилазы, полипептидазы, аминопептидазы и других биологически активных веществ, необходимых для дыхания клетки, синтеза белков и обмена веществ в целом [11].

Кобальт. Содержание кобальта в земной коре невысокое, около 18 мг/кг. В природных средах он находится в виде растворимых солей, содержащих Со²⁺ и Со³⁺, может также образовывать комплексный анион Со(ОН)^3-. С увеличением значения рН среды взаимодействие кобальта с минеральными и органическими компонентами почвы усиливается, а доступность микроэлемента для растений снижается.

В тканях растений находится в ионной и комплексной форме. Основная функция кобальта связана с его участием в фиксации атмосферного азота. Входит в состав коэнзима кобаламина (витамин В 12 ), метионинсинтетазы (синтез метионина, синтез белка), рибонуклеотидредуктазы (катализатор восстановления рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов, синтез ДНК и деление клеток), метил-коэнзим А-мутазы (синтез гема), которые необходимы для симбиотических микроорганизмов, усваивающих азот.

Кобальт способствует репродукции листьев растений, влияет на увеличение мезофилла, столбчатой и губчатой ткани. Благодаря переменной валентности кобальт участвует в окислительно-восстановительных реакциях, регулирует цикл Кребса, дыхание, энергетический обмен, биосинтез белка и полинуклеотидов. Стимуляция роста растений объясняется участием кобальта в регуляции баланса фитогормонов: ауксина и этилена.

Отмечено влияние кобальта на интенсивность фотосинтеза, а также увеличение содержания аскорбиновой кислоты в растениях. Недостаток кобальта может вызвать нарушения азотистого обмена, уменьшение в листьях количества хлорофилла, каротиноидов, витамина Е. Для риса кобальт наиболее важен на стадии кущения и выметывания метелок.

Медь. Медь выполняет роль катализатора в ферментативных процессах или входит в состав медьсодержащих ферментов: регулирует углеводный белковый обмен, катализирует окисление аскорбиновой кислоты, увеличивает процесс фотосинтеза, дыхания, препятствует разрушению хлорофилла в клетках. Медь участвует в регуляции гормонального баланса, входит в состав множества оксидаз, пластоцианинов, церулоплазмина и регулирует большинство окислительно-восстановительных процессов. Она повышает устойчивость растений к полеганию, засухо-, морозо- и жаростойкость [7]. Недостаток меди при выращивании риса вызывает бледность листьев, неполноценный выход метелки из влагалища, что резко снижает урожайность.

В качестве объекта исследований был выбран представитель злаковых – рис. Эта культура занимает одно из первых мест по потреблению населением, выращивается в южных областях и играет ведущую экономическую роль. Заинтересованность в изучении влияния нанопорошков на выращивание данной культуры выражают и наши вьетнамские партнеры. Рис имеет большую потребность во влаге, особенно на стадии прорастания. Эта культура широко распространена, ее возделывают и используют с древних времен. Семена риса сбалансированы по аминокислотному составу, отличаются прекрасными вкусовыми качествами и имеют высокую усвояемость. Крахмал, полученный из рисового зерна, является сырьем в текстильной, медицинской и парфюмерной индустрии. В сельском хозяйстве на корм животным используют рисовую солому. Не менее ценно использование ее для изготовления бумаги, картона, веревок, мешков, корзин и других подобных изделий. Урожайность риса, в зависимости от сорта и области выращивания, составляет 69– 80 ц/га.

Рис. 1. Проростки риса

Результаты и их обсуждение

Для определения влияния нанопорошков меди и кобальта на всхожесть, прорастание и развитие проростков риса использовали водные суспензии кобальта и меди. Суспензии объемом по 500 мл готовили из расчета каждого УДП на га посевной площади: 1 г/га, 0,1 г/га, 0,01 г/га. Диспергирование нанопорошков металлов готовили в ультразвуковой ванне (Град 13-35). Растворы УДП обрабатывали ультразвуком при максимальной мощности в течение 15 мин.

При проведении эксперимента брали партии по 1000 семян риса сорта Длиннозерный. Каждая партия семян выдержана в растворе соответствующей концентрации в течение 15 мин и помещена в грунт, состоящий из смеси почвы и глины в пропорции 1:3. В лотки с грунтом равномерно на расстоянии 1 см распределили обработанные семена, слегка заглубляя. Затем в лотки добавили отстоянной воды до уровня 1–3 мм над грунтом. Лотки с обработанными и контрольными семенами поместили в термостат с температурой 300С. Через 3 дня в каждой партии было подсчитано количество проростков и определена всхожесть и энергия прорастания. С 4-го дня лотки находились в лабораторных условиях на открытой поверхности при температуре 250С и естественном освящении. Через 10 дней проростки были извлечены из почвы, промыты водой, просушены и взвешены. В каждой исследуемой партии определено количество растений с наибольшими и наименьшими показателями, измерены массы надземной и подземной частей, длины зеленой и корневой части проростков (табл. 1, 2).

Из приведенных данных следует, что воздействие нанокристаллического кобальта наиболее благоприятно при минимальной концентрации. Под действием УДП меди лучшая всхожесть и энергия прорастания выявлена при максимальной концентрации, а наибольшая длина наземной и подземной частей проростков – при минимальной.

Таблица 1

Зависимость биометрических и морфофизиологических показателей ростков риса от воздействия наночастиц

Варианты	Энергия прорастания, %	Всхожесть, %	10-дневные проростки
			Длина проростка, мм	Длина корней, мм	Масса надземного ростка, г	Масса подземного ростка, г
контроль	72,0±0,1	76,1±0,2	86±0,4	100±0,3	0,22±0,004	0,04±0,0041
Cu 1 г/га	83,8±0,2	85,2±0,1	158±0,6	101±0,4	0,29±0,004	0,09±0,004
Cu 0,1 г/га	73,5±0,3	74,0±0,4	100±0,7	80±0,7	0,19±0,009	0,06±0,005
Cu 0,01 г/га	76,5±0,3	75,5±0,1	154±0,4	133±0,6	0,28±0,007	0,09±0,006
Co 1 г/га	63,1±0,2	70,5±0,2	101±0,8	95±0,2	0,25±0,009	0,08±0,007
Co 0,1 г/га	76,1±0,1	76,5±0,3	160±0,3	123±0,3	0,29±0,009	0,08±0,009
Co 0,01 г/га	97,5±0,3	98,5±0,2	120±0,6	127±0,5	0,27±0,002	0,09±0,002

Таблица 2

Соотношение минимальных и максимальных показателей ростков риса при взаимодействии с НП металлов

Варианты	Процент растений с длиной ниже средней	Мин. длина проростка, мм	Мин. длина корня, мм	Процент растений с длиной выше средней	Макс. длина проростка, мм	Макс. длина корня, см
контроль	20	65±0,72	100±0,74	30	100±0,46	100±0,44
Cu 1 г/га	10	65±0,21	95±0,60	15	220±0,50	100±0,31
Cu 0,1 г/га	15	40±0,52	60±0,37	15	160±0,56	100±0,56
Cu 0,01 г/га	10	51±0,65	32±0,25	25	200±0,69	170±0,39
Co 1 г/га	15	55±0,48	90±0,85	25	130±0,48	150±0,28
Co 0,1 г/га	5	40±0,31	50±0,33	15	200±0,73	110±0,19
Co 0,01г/га	10	40±0,09	30±0,20	20	160±0,19	170±0,22

Наибольший процент растений с максимальными длинами ростка и корня, а также фактическая длина наземной и подземной частей зафиксированы при минимальных концентрациях порошков меди и кобальта.

Очевидно, что металлы в наноразмерном состоянии, благодаря малому размеру частиц и способности к диффузии, способны на стадии прорастания семян проникать во внутриклеточные структуры корней и ростков. Увеличение энергии прорастания, всхожести, силы роста и других показателей отражает уровень обменных процессов, протекающих в семенах и проростках. Эффективность предпосевной обработки семян ультрадисперсными порошками металлов определяется на основании регистрируемых закономерностей в ответных реакциях при прорастании и развитии проростков.

Металлы в ультрадисперсном состоянии обладают принципиально иными свойствами в сравнении с металлами в их обычном виде. Помимо изменения оптических, электрических, магнитных свойств, параметров решетки наночастицы обладают развитой удельной поверхностью. Они активно вступают в химические взаимодействия с белковыми молекулами, образуют комплексы с органическими соединениями, требующими изучения их свойств и прогнозирования возможного токсического эффекта [2].

Механизм токсического действия наночастиц заключается в развитии комплекса реакций оксидативного стресса, вызванного их проникновением внутрь клетки [5]. Следствием является некроз и апоптоз отдельных клеток, угнетение физиологического статуса в целом. Экспресс-диагностика фитотоксичности наноматериалов основана на доступных методиках оценки биохимических и морфофизиологических показателей и не требует дорогостоящего молекулярноклеточного анализа [14].

Именно биохимический статус растения является критерием его адаптивной устойчивости. Многокомпонентная антиоксидантная защита, существующая в клетках растений, поддерживает динамическое равновесие между образованием активных форм кислорода (АФК) и их ликвидацией. Наиболее важными высокомолекулярными компонентами клеток растений, непосредственно обезвреживающими АФК, являются ферменты [13]. Оксидоредуктазы, в частности пероксидаза, играют ключевую роль в поддержании молекул в восстановленном состоянии, что является одним из основных условий для нормального существования живых организмов. В связи с этим современные авторы предлагают использовать измерение активности ферментов, как диагностический признак оценки устойчивости растений к действию стрессовых факторов.

Для определения активности ферментов проростки каждой партии разделены на три части для получения экстрактов. Навеску растительных образцов массой 800 мг охлаждают и растирают фарфоровым пестиком в ступке с добавлением в 0,5 мл охлажденного экстракционного буфера. Гомогенат помещают в центрифужную коническую пробирку и центрифугируют в течение 30 мин при 15000 g. Пробы помещают в холодильник. Материалом для исследования является супернатант (надосадочная жидкость) полученная из гомогената растительной ткани. Супернатант каждой партии делится на четыре части для проведения измерений по каждому ферменту, каждой концентрации с целью получения статистически достоверных данных.

Определение активности супероксиддисмутазы в растительных тканях. Принцип метода: в результате аутоокисления кверцетина в присутствии ТЕМЕД (тетраметилендиамин) в аэробных условиях происходит гиперация супероксидного анион-радикала, который в присутствии СОД подвергается дисмутации. Это проявляется в торможении реакции окисления кверцетина.

Реактивы: ЭДТА 0,5 мм раствор, ТЕМЕД 07,05М раствор, бикарбонатный буфер рН 10, крерцетин (97%) 0,5М раствор.

	холостая проба	контроль	опыт
раствор №1	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Буфер рН 10,0	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Дистилированная Н 2 О	2,0 мл	1,9 мл	1,8 мл
Биологический материал	–	–	0,1 мл
Кверцетин 0,5 М раствор	–	0,1 мл	0,1 мл

Исследования проводились на фотометре при λ = 406 нм. Замеры осуществляли через 10 мин.

Таблица 3

Активность супероксиддисмутазы (в усл. ед. акт./г сырой ткани) в корнях и ростках риса под воздействием нанопорошков кобальта (Со) и меди (Cu)

Варианты	Корни		Ростки
	абс. знач.	% к контр.	абс. знач.	% к контр.
контроль	1,46875	–	1,925926	–
Cu 1 г/га	1,633333	+ 11,21	2,038462	+ 5,84
Cu 0,1 г/га	1,548387	+ 5,42	2,16	+ 12,15
Cu 0,01 г/га	1,507937	+ 2,67	1,987897	+ 3,22
Co 1 г/га	1,540193	+ 4,86	2,211382	+ 14,82
Co 0,1 г/га	1,633333	+ 11,22	2,02682	+ 5,24
Co 0,01 г/га	1,548387	+ 5,42	1,981132	+ 2,87

Супероксиддисмутаза первой выступает в процессе защиты от окислительных повреждений, обрывая окисление клеточных макромолекул еще на стадии инициирования. Неблагоприятные факторы повышают образование активных форм кислорода, в том числе и радикалов супероксида. Наименьшее приращение СОД к контролю наблюдается при минимальной концентрации наночастиц меди и крайних (наибольшей и наименьшей) концентрациях кобальта (табл. 3). Активность супероксиддисмутазы зависит от стадии развития и физиологического статуса растения, напряженности стрессового фактора. Действие суперокиддисмутазы вызывает образование в клетке пероксида водорода, который в свою очередь угнетает работу фермента и, как следствие, ее эффективность зависит от деятельности других компонентов системы защиты, способных удалять пероксид водорода.

Определение активности пероксидазы в растительных тканях. Принцип метода основан на измерении оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении гваякола за определенный промежуток времени (продукт окисления тетрагваякол).

Реактивы: 0,15М ортофосфатный буфер рН 5,4, 0,15% раствор перекиси водорода, раствор гваякола (0,05% гваякол в 70⁰С этаноле 12,5 мг в 25 мл).

	контроль	исследуемая проба
Буфер рН 6,7	1,5 мл	1,5 мл
Биологический материал	0,5 мл	0,5 мл
Дистилированная Н 2 О	0,5 мл	-
0,05% спиртовой раствор гваякола	0,5 мл	0,5 мл

Исследования проводились на фотометре при λ = 470 нм. Перед началом измерений в каждую пробирку добавляли 0,5 мл перекиси водорода. Замеры осуществляли через 5 минут.

Активность каталазы (табл. 5) под действием нанопорошков кобальта и меди уменьшается в корнях и ростках проростков риса, однако характер изменений в данных частях отличается. В ростках активность каталазы, оставаясь ниже контроля, с повышением концентрации нанопорошка кобальта до 1 г/га возрастает и становится выше контроля. От общей закономерности отклоняется показатель активности пероксидазы (табл. 4). С увеличением концентрации кобальта в ростках активность уменьшается, а в корнях возрастает.

Таблица 4

Активность пероксидазы (в ед. опт.пл/г сырой ткани • сек) в корнях и ростках риса под воздействием нанопорошков кобальта (Со) и меди (Cu)

Варианты	Корни		Ростки
	абс. знач.	% к контр.	абс. знач.	% к контр.
контроль	0,004615	–	0,010038	–
Cu 1 г/га	0,005063	+ 9,70	0,011139	+ 10,97
Cu 0,1 г/га	0,0048	+ 4,00	0,012038	+ 19,93
Cu 0,01 г/га	0,004835	+ 4,75	0,010175	+ 1,36
Co 1 г/га	0,0055	+ 19,17	0,010884	+ 24,53
Co 0,1 г/га	0,005031	+ 9,01	0,011	+ 9,59
Co 0,01 г/га	0,0045	- 2,50	0,0125	+ 8,44

Определение активности каталазы в растительных тканях. Принцип метода основан на определении скорости разложения перекиси водорода каталазой исследуемого образца с образованием воды и кислорода.

Реактивы: фосфатный буфер рН 7,8; 10 мм/л раствор перекиси водорода.

	контроль	исследуемая проба
фосфатный буфер рН, 8,7	2,5 мл	2,6 мл
Биологический материал	-	0,02 мл
дистилированная Н 2 О	0,1мл	–
Перекись водорода	0,4 мл	0,4 мл

Исследования проводились на спектрофотометре при λ = 230 нм. Перекись водорода вносилась перед началом измерений. Замеры осуществляли через 30 сек в течение 5 мин.

Таблица 5

Активность каталазы (в усл. ед. акт./г сырой ткани) в корнях и ростках риса под воздействием нанопорошков кобальта (Со) и меди (Cu)

Варианты	Корни		Ростки
	абс. знач.	% к контр.	абс. знач.	% к контр.
контроль	0,004431818	–	0,048068182	–
Cu 1 г/га	0,004090909	- 7,62	0,047727273	- 0,71
Cu 0,1 г/га	0,005113636	- 15,38	0,046590909	- 3,07
Cu 0,01 г/га	0,003522727	- 20,51	0,043181818	- 10,17
Co 1 г/га	0,004204545	- 5,13	0,051136364	+ 6,38
Co 0,1 г/га	0,003409091	- 23,08	0,038977273	- 18,91
Co 0,01 г/га	0,00375	- 15,38	0,038409091	- 20,09

Рис. 2. Активность ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы, каталазы (в усл. ед. акт /г сырой ткани) в ростках риса под воздействием нанопорошков кобальта (Со) и меди (Cu) а) в ростках, б) в корнях

Стрессоустойчивость растительного организма может определяться по работе оксидазной системы клетки: активности пероксидазы и каталазы, которая свидетельствует о жизнеспособности растений. Данные ферменты конкурируют за субстрат – перекись водорода – и взаимозависимы. Повышение активности пероксидазы угнетает активность каталазы. Но данные ферменты имеют различное сродство к субстрату, и при низком содержании пероксида катализатором выступает пероксидаза, а при повышении концентрации катализирует процессы каталаза.

На данный момент критерием токсикологической оценки фитотоксичности любых наноматериалов является отклонение показателей на 30% и более. Нанопорошки кобальта и меди, применяемые в нашей работе для обработки семян риса, повысили активность пероксидазы и снизили активность каталазы, но данные изменения не выходили за установленные показатели (рис. 2). Максимальное уменьшение активности наблюдалось у каталазы под воздействием кобальта в концентрации 0,1 г/га и составляло 23%.

Микроэлементный состав растений, выращенных из семян, прошедших предпосевную обработку нанопорошками кобальта и меди, определяли с помощью рентгеновского энергодисперсионного анализатора IncaX-Max20 (OxfordInsr., USA) в составе растрового электронного микроскопа JSM6610LV (Jeol, Japan) со следующими характеристиками: ускоряющее напряжение – 15 кВ, низковакуумный режим, давление в рабочей камере – 30 Па, исследуемый сигнал – характеристическое рентгеновское излучение, рабочее (фокусное) расстояние – 10 мм, размер пятна – 60 отн. ед. (рис. 3). Измерения выполнены в лаборатории аналитических исследований Регионального Центра Зондовой Микроскопии коллективного пользования при Рязанском государственном радиотехническом университете.

Данное исследование показало изменение концентраций важных макро- и микроэлементов в исследуемых образцах (табл. 6, рис. 4, 5), которое непосредственно повлияло на увеличение биометрических показателей растений, обработанных УДП металлов.

Таблица 6

элемент	% содержания элемента в различных частях проростков риса
	корень, контроль	стебель, контроль	корень, обработан 0,1 г УДП кобальта	стебель, обработан 0,1 г УДП кобальта	корень, обработан 0,1 г УДП меди	стебель, обработан 0,1 г УДП меди
Si	2,4	6,9	1,5	8,9	1,7	4,5
K	0,8	3,3	1,2	2,6	4,5	4,0
P	0,1	0,5	0,1	0,7	0,1	0,4
Fe	0,7	0,1	0,5	0,3	0,5	0,3
Mg	0,4	0,1	0,9	0,3	0,6	0,2
Na	0,3	0,1	0,6	0,5	0,6	0,2

Нанопорошки кобальта и меди способствовали увеличению в корнях проростков магния и натрия, тем самым активизируя процессы фотосинтеза и увеличения синтеза углеводов. Превышение над контролем содержания калия и фосфора улучшает транспортную функцию, дыхание и создание энергетического резерва клетки.

Выводы

Минимальные концентрации, 0,1–0,01 г/га, ультрадисперсных меди и кобальта привели к увеличению всех морфометрических показателей, положительно влияли как на всхожесть, так и на развитие проростков. С повышением активности пероксидазы – активность каталазы снижалась. Совокупность этих изменений определяет стрессоустойчивость и жизнеспособность растений. В целом, изменение активности СОД, пероксидазы и каталазы в ростках и корнях проростков риса под действием нанопророшков исследуемых металлов в концентрациях 0,1 г/га и 0,01 г/га не вызывает стресса и не является токсичным.

Синергизм кобальта и меди проявляется в увеличении в корнях и ростках исследуемых растений жизненно важных микро- и макроэлементов. Элементный анализ образца гомогената проростков растений группы, экспонированной наночастицами Cо и Cu размерами 30–50 нм практически не определяет в тканях накопление данных элементов (рис. 4, 5).

Биотестирование наночастиц на растительных объектах позволяет, используя экономичные методы исследований, за короткие сроки получить результаты «положительного» воздействия ультрадисперсных суспензий металлов. Чувствительность растений к внешним воздействиям превышает таковую у животных объектов, поэтому на растительных объектах с высокой степенью достоверности можно изучать специфичность воздействия УДП, дозозависимость и экотоксичность.