Определение типа цитоплазматической мужской стерильности лука репчатого ( allium cepa L.) селекции ВНИИССОК с помощью молекулярных маркеров

Супрунова Т.П., Логунов А.Н., Логунова В.В., Агафонов А.Ф.; Suprunova T.P., Logunov A.N., Logunova V.V., Agafonov A.F.

Определение типа цитоплазматической мужской стерильности лука репчатого ( allium cepa L.) селекции ВНИИССОК с помощью молекулярных маркеров

Автор: Супрунова Т.П., Логунов А.Н., Логунова В.В., Агафонов А.Ф.

Журнал: Овощи России @vegetables

Рубрика: Современные направления селекции овощных культур

Статья в выпуске: 4 (13), 2011 года.

Бесплатный доступ

Впервые проведена оценка отечественных сортообразцов лука репчатого с помощью молекулярных маркеров на признак ЦМС. Выявлен полиморфизм по митохондриальным генам orfА501 и cob. Определены типы цитоплазмы у всех изученных образцов, что в дальнейшем позволит селекционерам сократить время, необходимое для отбора генотипов с определенным типом цитоплазмы и проведения скрещиваний.

Лук репчатый, цитоплазматическая мужская стерильность, молекулярные маркеры

Короткий адрес: https://sciup.org/14024907

IDR: 14024907 | УДК: 635.25:631.527.56:577.21

Determination of cytoplasmic male sterile factors in onion plants ( allium cepa L.) of VNIISSOK'S breeding

Molecular markers were used for screening of the onion plants of VNIISSOK's breeding for cytoplasmic male sterility. Allelic variations of the mitochondrial genes orfА501 and cob were reveled among studied onion samples. Use of the PCR-markers for these genes allowed identifying the cytoplasmic types of 14 onion genotypes. Application of these molecular markers in breeding program could help to select genotypes wit certain type of cytoplasm and may be useful for high throughput identification of cytoplasmic male sterile factors in large onion breeding populations.

Текст научной статьи Определение типа цитоплазматической мужской стерильности лука репчатого ( allium cepa L.) селекции ВНИИССОК с помощью молекулярных маркеров

За последние десятилетия, наряду с традиционными методами селек- ции, все чаще используется так называемая маркер-вспомогательная селекция (MAS – marker-assisted selection), в основе которой лежит использование молекулярных маркеров. Косвенный отбор на основе методов молекулярного генотипирования делает возможным детектирование желаемых аллелей и генотипов уже на ранних стадиях развития растения, что существенно сокращает и упрощает селекционный процесс.

На сегодняшний день известно два типа цитоплазматической мужской стерильности у лука – CMS-S (Jones and Emsweller, 1963) и CMS-T (Berninger, 1965), которые фенотипически практически неотличимы. Система CMS-S является результатом взаимодействия цитоплазматического фактора S и единичного ядерного гена-восстановителя фертильности (Jones and Clarke, 1943), в то время как CMS-T – более сложно наследуемая система, контролируемая тремя независимо сегрегированными локусами ядерного генома (Berninger, 1965). Благодоря своей устойчивости и стабильности в различных усло- виях окуружающей среды, система CMS-S широко используется селекционерами во всем мире для получения гибридных семян лука (Havey, 2000). Поскольку лук – двулетняя культура, идентификация CMS фактора (или типа цитоплазмы) занимает длительное время (от 4 до 8 лет) при ис- пользовании селекционерами традиционных методов генетики и селекции. Поэтому использование ДНК-маркеров, позво- ляющих различать типы цитоплазмы, является крайне важным для эффективного получения гибридных семян лука на основе мужской стерильности. Зарубежными учеными было разработано несколько моле- кулярных маркеров на митохондриальные и хлоропластные гены (orf, cob, psbA), обуславливающие ЦМС у лука репчатого и шнитт-лука (Sato, 1998; Engelke et al., 2003; Cho et al., 2006; Kim et al., 2009; Yamashita et al., 2010).

Целью данного исследования было определение типа ЦМС лука репчатого селекции ВНИИССОК с помощью молекуляр- ных маркеров.

Материалы и методы

В работе было использовано 14 коллекционных образцов лука репчатого (сте- рильных и фертильных), предоставленных лабораторией селекции и семеноводства луковых культур и лабораторией генетики и цитологии ВНИИССОК. Геномную ДНК выделяли из молодых листьев согласно методике Edwards и др. (1991). Полиме-разну цепную реакцию и электрофорез проводили по стандартной процедуре.

Результаты исследования

Для скрининга образцов лука репчатого селекции ВНИИССОК с целью определения у них типов ЦМС (CMS-S или CMS-T) и отличия их от нормальной, фертильной цитоплазмы (N) нами были использованы праймеры, разработанные учеными ранее (Engelke et at., 2003; Cho et al., 2006; Kim et al., 2009), на гены цитоплазматического генома (orf725, orfА501, cob, и psbA). В результате амплификации ПЦР-маркеров полиморфизм между 14-ю образцами лука был выявлен только по митохондриальным генам генам orfА501 и cob (рис.1). При этом, анализируя комбинацию полученных маркеров, можно определить тип цитоплазмы образцов лука репчатого. Согласно авторам, разработавшим данные ПЦР-маркеры (Sato, 1998; Engelke et al., 2003), если в образце амплифицируется либо

Рис. 1. Результаты амплификации молекулярных ПЦР-маркеров для cob и orfА501 генов у селекционных образцов лука реп чатого. Образцы 10-1ms, 20-ms, 22ms, 25ms, 8-2ms, 12ms, 225ms, 120.1ms с фенотипическими признаками мужской стерильности. Образцы 10-2mf, 21-mf, 23mf, 24mf, 7-1mf, 227mf фенотипически фертильны. М – маркер молекулярных весов 100 bp Ladder (Fermentas).

один cob-маркер либо оба маркера на гены orfА501 и cob, то данный генотип стерильный и имеет CMS-S тип цитоплазмы. Если в образце амплифицируется только маркер на orfА501-ген, то данный генотип также стерилен, однако имеет CMS-T тип цитоплазмы. Если в образце отсутствует амплификация обоих маркеров, то данный генотип фертилен и имеет N-цитоплазму.

В таблице представлены суммированные результаты амплификации cob и orfА501-маркеров, а также анализ комбинаций полу-

Результаты амплификации молекулярных маркеров cob и orfА501 и определение типа ЦМС в образцах лука репчатого

Образцы	cob- маркер	orfA501- маркер	Тип цитоплазмы, согласно молекулярному анализу	Определение стерильности, согласно фенотипическому анализу
10-1ms	–	+	CMS-Т	стерильный
10-2mf	–	–	N	фертильный
20ms	–	+	CMS-S	стерильный
21mf	+	–	CMS-S	фертильный
22ms	–	+	CMS-Т	стерильный
23mf	–	+	CMS-Т	фертильный
24mf	–	–	N	фертильный
25ms	–	+	CMS-Т	стерильный
7-1mf	+	–	CMS-S	фертильный
8-2ms	–	+	CMS-Т	стерильный
12ms	–	+	CMS-Т	стерильный
225ms	+	+	CMS-S	стерильный
227mf	–	–	N	фертильный
120.1ms	+	+	CMS-S	стерильный

Знак «-» означает отсутствие амплификации соответствующего маркера;

Знак «+» означает наличие амплификации соответствующего маркера.

ченных маркеров и сопоставление их с данными фенотипического анализа стерильности изученных образцов, проведенного сотрудниками лаборатории селекции и семеноводства луковых культур и лаборатории генетики и цитологии ВНИИССОК.

В результате проведенного исследования были установлены типы ЦМС у изученных образцов лука репчатого. При этом, у 11-ти из 14-ти изученных гентипов, результаты молекулярного анализа совпали с результатами фенотипического описания данных образцов по признаку стериль-ности/фертильности (Таб.1). Оставшиеся три образца – 21mf, 23mf и 7-1mf, согласно молекулярному анализу, имеют CMS-S или CMS-Т цитоплазму, но при этом, фенотипически они были фертильными. Мы можем сделать предположение, что данные образцы несут ядерные гены-восстановители фертильности, однако это требует дальнейших исследований.

По результатам молекулярного анализа три образца – 20ms, 225ms и 120.1ms, могут быть рекоммендованы для использования их в скрещивании для получения гибридов на основе ЦМС, поскольку они имеют CMS-S тип цитоплазмы, являющейся более простой в наследовании и устойчивой в различных условиях окуру-жающей среды системой мужской стерильности у луков.

Список литературы Определение типа цитоплазматической мужской стерильности лука репчатого ( allium cepa L.) селекции ВНИИССОК с помощью молекулярных маркеров

Berninger E. Contribution a l'?dute de la sterililite' male de l'oignon (Allium cepa L.).//Ann. Amelior. Plant. -1965. -V. 15. -P. 183-199.
Cho K-S., Yang T-J., Hong S-Y., Kwon Y-S., Woo J-G., Park H-G. Determination of cytoplasmic mail sterile factors in onion plants (Allium cepa L.) using PCR-RFLP and SNP markers.//Mol.Cells. -2006.-V. 21.-No.3. -P. 411-417.
Engelke T., Terefe D., Tatlioglu T. A PCR-based marker system monitoring CMS-(S), CMS-(T) and (N)-cytoplasm in the onion (Allium cepa L.).//Theor. Appl. Genet. -2003. -V.107. P. 162-167.
Edwards K., Johnstone C., and Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of genomic plant DNA for pCr analysis.//Nucleic Acids Res. -1991. -V. 19. -P. 1349.
Havey M.J. Diversity among male-sterility-inducing and male-fertile cytoplasms of onion.//Theor. Appl. Genet. -2000. -V. 101. -P. 778-782.
Jones H.A., Emsweller S.L. A male-sterile onion.//Proc.Amer.Soc.Hort.Sci.-1963. -V.34. -P. 582-585.
Jones H.A. and Clarke A. Inheritance of male sterility in the onion and the production of hybrid seed.//Proc.Amer.Soc.Hort.Sci. -1943. -V. 43. -P. 189-194.
Kim S., Lee E.T., Cho D.Y., Han T., Bang H., Patil B.S., Ahn Y.K., Yoon M.K. Identification of a novel chimeric gene, orf725, and its use in development of a molecular marker for distinguishing among three cytoplasm types in onion (Allium cepa L).//Theor. Appl. Genet. -2009. -V. 118. -P. 433-441.
Sato Y. PCR amplification of CMS-specific mitochondrial nucleotide sequences to identify cytoplasmic genotypes of onion (Allium cepa L.).//Theor. Appl. Genet. -1998. -V. 96. -P. 367-370.
Yamashita K., Tsukazaki H., Kojima A., Ohara T., Wako T. Inheritance mode of male sterility in bunching onion (Allium fistulosum L.) accessions.//Euphytica. -2010. -V. 173. -P. 357-367.

Еще