Определение триметоприма и энрофлоксацина в ветеринарном препарате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

«Московский физико-технический институт (государственный университет)», 2018

для профилактики и лечения телят, свиней, кур при инфекциях дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей, кожи.

Основными задачами исследования было подтверждение подлинности и количественное определение действующих веществ (Т и Э) в ветеринарном препарате. С этими задачами легко справляется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием. Учитывая уже разработанные методики [1-4], нами были внесены изменения для упрощения приготовления подвижной фазы и снижения себестоимости анализов.

Рис. 1. Структурная формула, триметоприма.

Рис. 2. Структурная формула, энрофлоксацина

Используемая аппаратура: жидкостной хроматограф SHIMADZU LC-2020, колонка. Poroshell ЕС-С18 (Agilent; 4, 6 х 50 мм; 2,7 мкм). Подвисисная фаза: элюент А / элюент В = = 80 / 20, где А — буферный раствор pH 2,4 и В — смесь растворителей (метанол / ацетонитрил = 1 / 2). Температура колонка: 50°С. Общий поток: 0,85 мл/мин. Время анализа: 5 мин. УФ: 270 нм. Инсисекционний вкол: 20 мкл.

Приготовление буферного раствора pH 2,4: в мерную колбу вместимостью 1000 см3 внести 2,5 см3 ортофосфорной кислоты и 900 см3 воды очищенной, перемешать, довести pH до 2,4 раствором натрия гидроокиси разведенным. Приготовление стандартного раствора триметоприма: около 0,016 г стандарта. Т (точная навеска) поместить в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавить 60 см3 ацетонитрила, перемешать и довести объём до метки водой очищенной (раствор В1); 5 см3 раствора А1 поместить в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавить 40 см3, перемешать, довести объем раствора до метки водой очищенной, тщательно перемешать (раствор А2). Приготовление стандартного раствора энрофлоксацина: около 0,033 г стандарта. Э (точная навеска) поместить в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавить 60 см3 ацетонитрила, перемешать и довести объём до метки водой очищенной (раствор А1); 5 см3 раствора В1 поместить в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавить 40 см3, перемешать, довести объем раствора до метки водой очищенной, тщательно перемешать (раствор В2). Приготовление раствора бланка: в мерную колбу вместимостью 100 см3 внести 6 см3 ацетонитрила и довести объем раствора до метки водой очищенной, тщательно перемешать. Приготовление раствора препарата: около 0,386 г препарата (точная навеска) внести в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавить 60 см3 ацетонитрила, перемешать и довести объем раствора до метки водой очищенной, тщательно перемешать (раствор С1); 5 см3 раствора С1 поместить в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавить 40 см3, перемешать, довести объем раствора до метки водой очищенной, тщательно перемешать (раствор С2).

Выполнены два условия для подтверждения подлинности Т и Э (табл. 1, 2): 1) время выхода пиков стандартов совпадает со временем выхода основных пиков действующих веществ в препарате; 2) УФ спектры стандартов совпадают с УФ спектрами основных пиков в препарате [3].

Таблица!

Данные растворов стандартов триметоприма (1) и энрофлоксацина (2) и раствора препарата (3, 4)

Количественное определение легко осуществляется с использованием программы LabSolutions (Postrun). Задача разделения хроматографических пиков двух действующих веществ препарата достигнута с высокими показателями (табл. 1, № 3-4): разрешение > 5; эффективность колонки > 2600 теоретических тарелок (ТТ) или > 52000 ТТ/м) ; хвостовой фактор ~ 1.1; коэффициенты удерживания — 8 и 11. Это соответствует современным фармакопейным требованиям к параметрам пригодности хроматографической системы [5].

Массовую концентрацию действующего вещества (ДВ) в препарате вычисляем по формуле

У = (5Пр х тп,м х р) / (>SCT х ттгпр), где У — массовая концентрация ДВ в препарате, мг/мл; Snp — площадь пика ДВ в растворе препарата; Дст — площадь пика ДВ в растворе стандарта; ттгст — масса навески ДВ, мг; m.np — масса навески препарата, взятого для анализа, г; р — плотность препарата, г/мл.

Разработанный метод имеет несколько преимуществ, непосредственно влияющих на себестоимость анализов: 1) простота приготовления подвижной фазы и испытуемых растворов; 2) короткое время анализа - 5 мин; 3) возможность количественного определения двух ДВ за один анализ при одной длине волны; 4) состав подвижной фазы, где только 20% смеси дорогостоящих растворителей метанол и ацетонитрил (1/2); 5) небольшой общий поток (0,85 мл/мин).

Таблица2

Хроматограммы и УФ спектры растворов стандартов триметоприма и энрофлоксацина и раствора препарата

Вывод. Разработан новый метод ВЭЖХ анализа и контроля качества готового лекарственного препарата с содержанием триметоприма и энрофлоксацина. Стандартное отклонение количественного определения (%) триметоприма составила 0,35, энрофлоксацина — 0,07. Представленный хроматографический метод рекомендуется использовать для одновременного определения триметоприма и энрофлоксацина по разделу «подлинность» и «количественное определение».