Оптические характеристики фракций органического вещества агрегатов типичных черноземов

Органическое вещество (ОВ) почв является важным компонентом биосферы. Оно во многом определяет плодородие почв, значимо участвует в глобальном круговороте углерода, влияет на устойчивость почв к негативным воздействиям (Орлов, 1992). Органическое вещество почв – сложная система, поэтому для его изучения в зависимости от целей исследования выделяют те или иные фракции. Это могут быть фракции, различающиеся по размерам, морфологии, плотности, устойчивости к температурным воздействиям, биодеградации, а также растворимости в различных экстрагентах (Тюрин, 1965; Тюрин, Найденова 1951; Хан, 1969; Elliott, 1986; Jastrow, 1996; Six et al., 1998; Six et al., 2000; Когут и др., 2009; Артемьева, 2010; Когут и др., 2010; Gregorich et al., 2015).

Большинство приемов фракционирования призваны выделить две глобальные части неживого ОВ: это устойчивую во времени и быстро оборачиваемую. Первая фракция обеспечивает накопление ОВ с большим сроком оборота во времени, поддерживает устойчивость и буферность почв. Быстро оборачиваемое ОВ является источником доступного для растений азота, способствует активному формированию водоустойчивости структуры, поставляет вещество для устойчивой части почвы, способствует восстановлению структуры. При этом фракции ОВ, оцениваемые различными методами, часто коррелируют между собой в зависимости от их функциональности. Например, показана строгая корреляция между содержанием термолабильного вещества и количеством минерализуемого микроорганизмами углерода ( Gregorich et al., 2015 ).

Фракции, выделяемые на основе растворимости, исторически первыми использованы для изучения ОВ. Большую роль в разработке данной методологии внес И.В. Тюрин. Им разработан ряд схем выделения ОВ из почвы ( Тюрин, 1965 ; Тюрин, Найденова 1951 ). Одним из путей характеристики получаемых фракций является спектроскопия в ультрафиолетовой ( УФ ) и видимой областях ( Кононова, 1963 ). С развитием других подходов этот метод утратил популярность в силу низкой информативности и высокой трудоемкости. Однако в последнее время с появлением приборов, автоматически считывающих УФ–видимый спектр, и автоматических анализаторов углерода, трудоемкость метода заметно уменьшилась, а информативность напротив повысилась. В настоящее время характеристика фракций ОВ с помощью УФ–видимых спектров является перспективным экспресс-методом (Yan et al., 2016)

Для описания УФ–видимых спектров обычно используют три основных дескриптора. Первый – параметр SUVA254 – относительная ароматичность, который рассчитывают как отношение поглощения при 254 нм от содержания в растворе углерода, он общепринят при анализе природных вод (Vergnoux et al., 2011; Yan et al.,

2016) . Второй показатель – E4/E6, широко используемый в отечественном и зарубежном почвоведении: отношение интенсивностей в спектре при длине волн 465 и 665 нм, характеризующий цветность ОВ ( Кононова, 1963 ), часто называют степенью гумификации. Третий показатель – E2/E3 – отношение интенсивностей при 250 и 365 нм также часто рассматривают как степень гумификации ОВ (Vergnoux et al., 2011) . Однако сопоставление параметров E2/E3 и E4/E6 показывает, что они могут характеризовать разные аспекты строения ОВ. Исходя из физико-химических параметров спектрофотометрии, показатель E4/E6 можно рассматривать как отношение содержания ароматических фрагментов к алифатическим, в то время как показатель E2/E3, как отношение содержания неокислен-ных ароматических структур к окисленным ( Зигбан и др., 1971 ).

В результате появляется задача сопоставления указанных показателей на детерминированных объектах с целью выяснения их пригодности как дескрипторов гумификации. Наиболее подходящими объектами для данных исследований являются многолетние опыты. Кроме того, перспективно оценить перечисленные показатели для разных фракций ОВ, различающихся по степени разло-женности, а для большей детерминированности объектов исследовать не средние образцы почв, а предварительно выделенные агрегаты.

Цель работы – изучение УФ–видимых спектров поглощения фракций гуминовых веществ, лабильных гуминовых веществ, растворимых органических веществ, выделенных из мелких, средних и крупных агрегатов типичных черноземов многолетних опытов разного вида использования. В качестве видов использования выбраны контрастные варианты черноземов по балансу органического вещества: бессменный черный пар и степь.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали типичные черноземы ( Классификация..., 1977 ) (согласно международной классификации ФАО – Chernozem ( Word Rreference Base…, 2015 )) многолетних полевых опытов, различающихся интенсивностью воздействия на почву: “бессменный черный пар с 1964 г.” и “заповедная ежегодно косимая степь”. Таким образом, в первом случае в почву уже более 50 лет не поступало свежее растительное вещество, а второй

Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева. 2017. Вып. 90 вариант является типичным для ненарушенного степного чернозема с установившимся балансом ОВ.

Образцы типичного чернозема варианта “бессменный черный пар с 1964 г.” – далее в тексте обозначается “пар” – отбирали на длительном многолетнем полевом опыте Почвенного института им. В.В. Докучаева на территории Курского НИИ АПП (опыт заложен в 1964 г.), а вариант “ежегодно косимая степь” – далее в тексте обозначается “степь” – в Центрально-черноземном государственном биосферном заповеднике им. В.В. Алехина. Эти участки расположены достаточно близко друг от друга (около 20 км).

Для отбора образцов закладывали площадку опробования радиусом 5 м. В качестве образца отбирали полный объем, занимаемый почвой, примерно 15×15×25 см, массой около 5 кг, глубина отбора 0–15 см. Такой подход позволяет избежать потерь и искусственного перераспределения размерных фракций агрегатов в процессе отбора. Образцы высушивали на воздухе. Из полученных образцов сухим просеиванием выделяли мелкие 0.5–0.25 мм, средние 2–1 мм и крупные 10–7 мм агрегаты. Фракции выбраны в связи с тем, что предыдущие работы с данными объектами дают веские основания предполагать разные механизмы трансформации ОВ для этих размеров агрегатов ( Сысуев, 2005 ; Холодов и др., 2016 ).

Содержание углерода в образцах определяли сухим сжиганием в токе кислорода, оно составило 2.4 и 5.4% для пара и степи соответственно. Кроме того, оценена водоустойчивость образцов методом просеивания в воде ( Вадюнина, Корчагина, 1986 ). На основе полученных данных рассчитан средневзвешенный диаметр водоустойчивых агрегатов ( Шеин, 2006 ). Этот показатель составил 0.5 и 4.9 мм для вариантов пар и степь соответственно.

Из образцов агрегатов выделены три фракции, различающиеся по растворимости:

• –    фракция растворимого органического вещества ( РОВ ), ее извлекали водной вытяжкой;

• –    фракцию лабильных гуминовых веществ ( ЛГВ ) извлекали прямой 0.1 M NaOH вытяжкой;

• –    фракцию гуминовых веществ ( ГВ ) экстрагировали 0.1 M NaOH вытяжкой из почвы, предварительно декальцинированной 0.1 М HCl.

РОВ извлекали очищенной водой, не содержащей CO 2 , с удельным сопротивлением 18 Мом см. Отношение почва : вода по массе составило 1 : 5. Закрытую суспензию встряхивали 8 ч, затем отделяли РОВ от осадка центрифугированием.

ЛГВ выделяли методом Тюрина ( Тюрин, Найденова, 1951 ) в модификации Когута–Булкиной ( Когут, Булкина, 1987 ). Все манипуляции аналогичны выделению РОВ, только в качестве экстрагента использовали 0.1 M NaOH, приготовленный на очищенной воде, не содержащей CO 2 , с удельным сопротивлением 18 Мом см.

Фракция ГВ представляет собой сумму фракций 1 и 2 по Тюрину ( 1965 ), также ее можно рассматривать как ГВ, извлекаемые в ходе их препаративного выделения без отделения фульвокислот от гуминовых ( Холодов и др., 2015 ). Для извлечения ГВ навеску почвы подкисляли 1 M HCl до рН 1 суспензии, затем добавляли 0.1 M HCl до отношения почва : раствор, равного 1 : 5. Суспензию встряхивали 4 ч, затем отделяли супернатант центрифугированием. Осадок нейтрализовывали 1 M NaOH до рН 7, затем добавляли 0.1 M NaOH до отношения почва: раствор 1 : 5. Суспензию встряхивали 8 ч, затем отделяли ГВ от осадка центрифугированием. Все реактивы готовили на очищенной воде, не содержащей CO 2 , с удельным сопротивлением 18 МОм см.

В полученных вытяжках оценивали содержание ОВ на основе концентрации органического углерода. Определение проводили на анализаторе общего углерода ТОС-VCSH, Shimadzu.

Структуру ОВ полученных фракций исследовали методом УФ–видимой спектроскопии. Для возможности сравнения спектров аликвоты всех фракции переносили в фосфатный буфер с рН 6.8 и ионной силой 0.03 M.

УФ–видимые спектры снимали на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 в диапазоне 200–800 нм, раствором сравнения служил фосфатный буфер. На основе полученных данных рассчитывали показатели: SUVA254, E2/E3 и E4/E6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выход фракций ОВ оценивали по содержанию органического углерода (С орг , мг/л) в вытяжках 1 : 5. Данные приводятся в табл. 1.

Количественный выход органического вещества в вытяжках закономерно возрастает в ряду РОВ, ЛГВ, ГВ. Интересно отметить, что лабильных форм ОВ (РОВ и ЛГВ) больше в структурных отдельностях варианта пар, а ГВ экстрагируется больше в варианте степь. Известно, что РОВ и ЛГВ связывают с поступлением свежего органического вещества и с формированием водоустойчивости структуры (Six et al., 2000). Однако в данном случае вариант степь характеризуется гораздо большей водоустойчивостью по сравнению с паром (Холодов и др., 2016). Кроме того, вариант опыта бессменный черный пар подразумевает отсутствие на нем растительности в течение всего вегетационного сезона и, соответственно, отсутствие поступления растительных остатков в почву, опыт проводится с 1964 г. Таким образом, при экстракции водой и щелочью без декальцирования извлекаются не только ОВ, недавно попавшие в почву, но и продукты разрушения относительно “старого” ОВ. При этом лабильные продукты деструкции ОВ не придают почве водоустойчивости. Следует отметить, что по содержанию углерода в вытяжках существенных различий между агрегатами не выявлено.

Полученные величины концентрации углерода были использованы для нормирования оптических плотностей в спектрах и расчета показателя SUVA254.

Для примера, на рис. 1 приводятся спектры, нормированные на содержание углерода, полученные для фракций ОВ, выделенных из агрегатов 2–1 мм типичных черноземов в вариантах – ежегодно косимая степь и бессменный пар.

Спектры фракций ОВ других структурных отдельностей в целом были близки к аналогичным фракциям агрегатов 2–1 мм.

При анализе спектров обращает на себя внимание высокая оптическая плотность в спектре РОВ ежегодно косимой степи. Для области 200–300 нм оптическая плотность РОВ в этом варианте

Таблица 1. Содержание С орг в вытяжках из агрегатов типичных черноземов для вариантов использования степь и пар, мг/л

Размер агрегатов, мм	РОВ		ЛГВ		ГВ
	степь	пар	степь	пар	степь	пар
0.5–0.25	3	5	6	11	25	19
2–1	2	5	5	11	26	18
10–7	3	5	6	11	21	18

Рис. 1. УФ–видимые спектры поглощения, нормированные на содержание углерода фракций ОВ, выделенных из агрегатов 2–1 мм ежегодно косимой степи (а) и бессменного пара (б).

превышает показатели для ЛГВ и ГВ. В варианте пар такого эффекта не наблюдается: оптическая плотность РОВ в структурных отдельностях этой почвы заметно ниже по сравнению с другими фракциями, при этом ее спектр подобен спектру ЛГВ этого варианта. В свою очередь спектр ЛГВ варианта пар аналогичен спектру ЛГВ варианта степь, а спектры ГВ обоих вариантов ведут себя одинаково.

Выше отмечено большое количество лабильных ОВ, которые извлекаются из чернозема под паром, вероятно, это продукты разрушения устойчивых ОВ. Сопоставление спектров РОВ, ЛГВ и ГВ

Бюллетень Почвенного института им. В.В. Докучаева. 2017. Вып. 90 обеих почв указывает на иной характер спектра РОВ варианта степи по сравнению со всеми остальными вариантами, полученными как из пара, так и из степи. В то же время спектры ЛГВ и ГВ весьма сходны. Таким образом, учитывая, что фракция ЛГВ включает в себя и РОВ, а водоустойчивость структуры во многом обеспечивается ОВ лабильных фракций (Six et al., 2000) , и факт, что водоустойчивость варианта степь гораздо выше по сравнению с вариантом пар, наиболее вероятно предположить, что водоустойчивость структуры чернозема обеспечивается в первую очередь фракцией РОВ.

Для количественной характеристики спектров поглощения рассчитаны параметры SUVA254, E2/E3 и E4/E6.

На рис. 2. приводятся значения параметра SUVA254 рассматриваемых фракций ОВ для агрегатов разных размеров черноземов в вариантах использования пар и степь.

SUVA254 отражает содержание ароматических фрагментов в ОВ (Weishaar et al., 2003) . В варианте пар этот параметр закономерно снижается при переходе от ГВ к ЛГВ и далее к РОВ. Учитывая особенности этого опыта – тотальное доминирование процессов разложения ОВ – можно заключить, что при разложении ГВ преимущественно разрушаются молекулы с меньшим содержанием ароматических фрагментов. Видимо, этим объясняется меньшее значение параметра SUVA254 во фракции ГВ в варианте степь по сравнению с вариантом пар. При этом показатель SUVA254 для ЛГВ варианта степь (0.025–0.030 л/(см мг)) практически не отличается от варианта пар (0.027–0.030 л/(см мг)). Однако этой фракции из варианта пар извлекается почти в два раза больше. Возможно, что во фракции, которую традиционно относят к ЛГВ и считают новообразованными гуминовыми веществами, доминируют продукты деструкции гуминовых веществ.

Величины SUVA254 фракции РОВ в варианте степь (0.032– 0.049 л/(см мг)) существенно превышают таковые для ЛГВ этого варианта и РОВ варианта пар (0.017–0.021 л/(см мг)). Вероятно, учитывая, что ЛГВ включает в себя и ОВ, которые экстрагируются водой, РОВ варианта степь содержит большую долю свежепосту-пивших в почву ОВ.

Рис. 2. Значения параметра SUVA254 для фракций РОВ, ЛГВ и ГВ, извлекаемых из агрегатов разных размеров типичных черноземов в вариантах использования пар и степь.

Сравнение SUVA254 между агрегатами показывает, что этот показатель у РОВ агрегатов 2–1 мм варианта степь существенно выше по сравнению с РОВ других агрегатов.

Показатель Е2/Е3 отражает отношение максимума поглощения, связанного с ароматическими фрагментами к полосе поглощения электронного переноса (Korshin et al., 1997) . Полученные значения этого показателя приводятся на рис. 3.

Для обоих вариантов показатель E2/E3 возрастает в ряду ГВ, ЛГВ, РОВ. Таким образом, в ряду во фракциях ОВ увеличивается доля зон электронного переноса (двойные связи, ковалентные, неполярные связи у углерода бензольного конца, функциональные группы) и уменьшается доля ароматических фрагментов.

Различия между агрегатами выявляются для ЛГВ и РОВ. Среди фракций ЛГВ показатель Е2/Е3 был меньше в агрегатах 0.5– 0.25 мм в варианте степь по сравнению с другими агрегатами этого варианта. Характеристики Е2/Е3 РОВ из агрегатов различаются для

Рис. 3. Значения параметра E2/E3 для фракций РОВ, ЛГВ и ГВ, извлекаемых из агрегатов разных размеров типичных черноземов в вариантах использования пар и степь.

разных размеров в обоих вариантах. В варианте степь показатель увеличивается вместе с размерами агрегатов. В варианте бессменный пар значения для мелких (0.5–0.25 мм) и крупных (10–7 мм) агрегатов близки, а для РОВ агрегатов 2–1 мм – выше.

Дескриптор Е4/Е6 отражает отношение ароматических фрагментов ОВ к алифатическим. Полученные значения приводятся на рис. 4. В отличие от вышерассмотренных показателей параметр E4/E6 не образовывал ряд ГВ, ЛГВ, РОВ. Максимум наблюдали для ЛГВ, затем РОВ и ГВ. Для ГВ этот показатель был несколько выше в варианте степь, а для ЛГВ – в варианте пар, для РОВ – величины были примерно одинаковыми в обеих почвах.

Различия между агрегатами, как и в случае Е2/Е3, выявляются для ЛГВ и РОВ, однако тенденции наблюдаются иные. Так, показатель Е4/Е6 для ЛГВ, в варианте пар был меньше в агрегатах

E4/E6

Агрегаты, мм 0.5—0.25

ь 2—1

10—7

Рис. 4. Значения параметра E4/E6 для фракций РОВ, ЛГВ и ГВ, извлекаемых из агрегатов разных размеров типичных черноземов в вариантах использования пар и степь.

2–1 мм, чем в двух других. В варианте степь наоборот для 2–1 мм наблюдали максимум, затем следовали ЛГВ агрегатов 0.5–0.25 и 10–7 мм.

Характеристики Е4/Е6 РОВ из агрегатов различаются в обоих вариантах. В варианте степь наименьший показатель характерен для агрегатов 2–1 мм, затем следует РОВ из 0.5–0.25 и 10–7 мм. Для варианта пар наибольшее значение РОВ из 2–1 мм, после РОВ из 0.5–0.25 и 10–7 мм.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Продемонстрировано различие трех рассмотренных параметров, характеризующих спектр поглощения почвенного ОВ. Они изменяются не единообразно, следовательно, характеризуют независимые аспекты строения ОВ. В связи с этим перспективно совместное использование этих дескрипторов для характеристики ОВ оптическими методами.

Иногда показатели E2/E3 и Е4/Е6 называют степенью гумификации, степенью разложенности или подобными терминами. Проделанная работа демонстрирует, что использование термина “степень гумификации” не до конца оправдано: показатель Е4/Е6 характеризует максимум для фракции ЛГВ, в то время как наибольшая степень гумификации по условиям опыта должна быть во фракции ГВ, а использование E2/E3 требует дальнейшего исследования. Следует отметить, что в отечественной школе Е4/Е6 называют коэффициентом цветности, а не степенью гумификации.

Показатель Е4/Е6 обычно обратно связан с молекулярными размерами ОВ, а для E2/E3 отмечают обратную корреляцию с молекулярным весом и ароматичностью, SUVA254 отражает содержание ароматических фрагментов (Peuravuori, Pihlaja 1997; Stack et al., 2015 ; Thurman, 1985) . В связи с этим при совместном использовании этих оптических дескрипторов правильнее трактовать наблюдаемые различия и (или) изменения в характеристиках ОВ, отражаемые этими показателями.

Благодарность. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-04-01503 с привлечением оборудования Центра коллективного пользования научным оборудованием “Функции и свойства почв и почвенного покрова” Почвенного института им. В.В. Докучаева.