Оптимизация аутологичных дендритно-клеточных вакцин для лечения больных злокачественными новообразованиями

Создание терапевтических вакцин на основе дендритных клеток (ДК) рассматривается как один из перспективных подходов в комплексной терапии злокачественных новообразований, результаты международных и отечественных клинических исследований свидетельствуют о клинической эффективности данного метода лечения у некоторых категорий больных [1, 2, 5]. Вместе с тем использование ДК-вакцин, обладающих эффективностью, безопасностью и надлежащим уровнем качества в рутинной клинической практике, предполагает оптимизацию и стандартизацию рекомендованных методик [3, 8, 9].

Дифференцировка вакцинных ДК из моноцитов периферической крови in vitro с использованием различных питательных сред, ростовых факторов и факторов дифференцировки различной активности в ряде случаев препятствует получению стандартного клеточного продукта охарактеризованного качества. В частности, появление на фармацевти- ческом рынке гранулоцитарно-макрофагеального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) Неостим отечественного производства (Фарм-синтез, Россия) для клинического использования позволяет заменить дорогостоящий импортный аналог GM-CSF (СellGenix, Германия) и значительно удешевить стоимость изготовления ДК-вакцин. Вместе с тем предполагаемый технологический переход не изучен. Более того, не определена оптимальная концентрация интерлейкина-4 (IL-4), в присутствии которого осуществляется дифференцировка ДК из моноцитов периферической крови. Более чем в 200 клинических исследованиях были использованы различные концентрации IL-4 без достаточно аргументированного обоснования, чаще в диапазоне от 6,75 нг/мл до 180 нг/мл [7, 11]. Несомненно, это затрудняет стандартизацию ДК-вакцин, что определило проблему научного поиска и цель настоящего исследования.

Целью исследования является изучение иммунологического фенотипа незрелых и зрелых ДК, дифференцированных из моноцитов периферической крови больных злокачественными новообразованиями в присутствии фиксированной концентрации GM-CSF (CellGenix, Германия) или ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия), и различных концентраций IL-4 (СellGenix, Германия).

Материал и методы

Дифференцировку ДК из адгезионной моноцитарной фракции мононуклеаров периферической крови больных меланомой кожи проводили в сбалансированной бессывороточной среде «Cell-Gro DC», приготовленной в условиях надлежащей производственной практики GMP (Cell Genix, Германия), адгезионных культуральных флаконах с вентилируемыми крышками (Sarstedt, Германия) в условиях СО2 инкубатора «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) при 37°С, 5 % CO2 и 98 % влажности. В исследовании использовали ростовой фактор GM-CSF (CellGenix, Германия) и ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия) в ранее изученной концентрации 72 нг/мл и IL-4 (CellGenix, Германия) в интервале концентраций от 0 до 45 нг/мл. Ростовые факторы и фактор дифференцировки вносили на 1, 3 и 5-й день культивирования (незрелые ДК). На 7-й день вносили коктейль лизированных охарактеризованных аутологичных и/или аллогенных опухолевых клеток (клеточные линии Mel 226, Mel 515, Mel 519, Mel 520), экспрессирующих иммуногенные раково-тестикулярные антигены (NY-ESO-1+, MAGE+, HAGE+, GAGE+) и фактор некроза опухоли (TNFα) 20 нг/мл (BD, США). Инкубацию с опухолевым лизатом проводили в течение 48 ч.

Таблица 1

Иммунофенотип зрелых ДК, выращенных в присутствии ростового фактора GM-CSFразличных производителей и -4, M±m, δ

Дифференцировочные/ линейноспецифические антигены	GM-CSF Фармсинтез, Россия	GM-CSF CellGenix, Германия	Критерий Фишера (F), уровень значимости (p)
CD14+	2,02 ± 0,91 %; 3,18	6,12 ± 2,34 %; 5,17	F=3,91; p=0,07 (>0,05)
CD1a+	24,03 ± 9,11 %; 26,22	20,08 ± 9,13 %; 23,01	F=0,07; p=0,79 (>0,05)
CD83+	82,15 ± 6,07 %; 18,34	66,14 ± 4,21 %; 10,12	F=3,85; p=0,07 (>0,05)
CD1a+ CD83-	13,11 ± 5,01 %; 15,12	13,23 ± 6,16 %; 15,32	F=0,001; p=0,97 (>0,05)
CD1a+CD83+	10,12 ± 4,06 %; 13,10	8,12 ± 4,21 %; 11,15	F=0,08; p=0,78 (>0,05)
CD1a-CD83+	72,22 ± 9,12 %; 27,15	59,41 ± 7,26 %; 17,16	F=1,10; p=0,31 (>0,05)
CD83+ CD86+	47,05 ± 7,11 %; 21,14	51,24 ± 6,12 %; 15,16	F=0,11; p=0,74 (>0,05)
CD83+ CD80+	78,23 ± 5,07 %; 15,10	65,25 ± 4,12 %; 9,06	F=3,63; p=0,08 (>0,05)
CCR7+	83,23 ± 8,02 %; 24,14	82,56 ± 11,31 %; 28,31	F=0,01; p=0,94 (>0,05)
CCR7+CD83+	76,16 ± 9,13 %; 23,43	64,14 ± 7,16 %; 13,05	F=0,74; p=0,41 (>0,05)
HLA DR+	93,03 ± 2,11 %; 6,23	91,31 ± 5,33 %; 12,14	F=0,17; p=0,68 (>0,05)

Примечание: M – среднее значение экспрессии иммунофенотипического маркера, m – ошибка среднего значения, δ – стандартное отклонение, концентрация GM-CSF – 72 нг/мл, IL-4 – 45 нг/мл.

Подсчет количества и оценку жизнеспособности ДК осуществляли с помощью автоматического счетчика клеток «Countess ™ » («Invitrogen», США) и 0,4 % трипанового синего (Sigma, США). Экспрессию линейноспецифических и дифферен-цировочных антигенов на моноцитах, незрелых и зрелых ДК изучали с помощью моноклональных антител (DAKO, Дания) и системы визуализации «In vision» (DAKO, Дания) для иммуноцитохимического метода; напрямую меченных флуорохро-мами моноклональных антител (anti-CD83-PE-Cy5, anti-CD1а-PE, anti-CD80-FITC, anti-CD86-FITC, anti-CD14-FITC, anti-CCR7-FITC, anti-HLA-DR-Per CP-Cy5.5), для метода лазерной проточной цитофлуориметрии («BD Biosciences», США). В последнем случае использовали программное обеспечение CellQuest Pro (tm).

Оценку результатов исследования проводили с помощью описательной статистики, однофакторного дисперсионного и регрессионного анализа [4].

Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ экспрессии иммуно-фенотипических маркеров зрелых ДК, дифференцированных в присутствии фиксированной концентрации ростового фактора GM-CSF (CellGenix, Германия) или ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия) 72 нг/мл в сочетании с IL-4 (CellGenix, Германия) 45 нг/мл (табл. 1), не выявил статистически значимых различий (р>0,05), что свидетельствует о сопоставимой активности ростовых факторов импортного и отечественного производства. Вместе с тем интересным является изучение особенностей дифференцировки ДК на разных стадиях созревания в присутствии ГМ-КСФ отечественного производства.

Результаты исследования (табл. 2) демонстрируют дифференцировку моноцитов в незрелые ДК: появление на клеточной мембране молекулы CD1a (71 ± 4,01 %) и утрату CD14 (3,02 ± 1,01 %). Зрелые ДК характеризуются высокой экспрессией маркера дифференцировки CD83 (76,1 ± 4,01 %) и утратой CD1a антигена (22,03 ± 6,02 %), а также статистически достоверным усилением экспрессии костимулирующих молекул CD80 с 31,01 ± 12,02 % до 73,03 ± 4,02 % (р=0,0003) и CD86 с 8,01 ± 2,02 % до 49,11 ± 5,03 % (р=0,00001). Высокий уровень экспрессии молекул хемокинового рецептора (CCR7), обеспечивающего миграцию зрелых ДК в лимфатические узлы, и белков, участвующих в презентации антигена (HLA DR) на 7-й и 9-й день культивирования, свидетельствует о созревании ДК.

Уровень зрелости ДК определяли по коэкспрес-сии антигенов CD1а и CD83. Анализ результатов свидетельствует о снижении содержания незрелых ДК (CD1a+CD83-) с 52,01 ± 11,02 % до 13,01 ± 4,02 % (р=0,0003) и увеличении зрелых ДК (CD1a-CD83+) с 11,01 ± 4,04 % до 67,05 ± 6,02 % (р=0,00001) ДК к 9-му дню культивирования. Низкое содержание ДК промежуточной степени зрелости (CD1a+CD83+) в

Таблица 2

Сравнительный анализ иммунофенотипа ДК на разных стадиях созревания, M±m, δ

Дифференцировочные/ линейноспецифические антигены	ДК незрелые (7-й день)	ДК зрелые (9-й день)	Критерий Фишера (F), уровень значимости (p)
CD1a+	71,12 ± 4,01 %; 11,21	22,03 ± 6,02 %; 24,36	F=25,73; p=0,00001 (<0,05)
CD14+	3,02 ± 1,01 %; 3,18	4,04 ± 1,02 %; 4,13	F=0,25; p=0,62 (<0,05)
CD83+	32,02 ± 12,1 %; 33,26	76,1 ± 4,01 %; 17,41	F=17,18; p=0,0005 (<0,05)
CD1a+ CD83-	52,01 ± 11,02 %; 29,42	13,01 ± 4,02 %; 14,21	F=18,59; p=0,0003 (<0,05)
CD1a+CD83+	21,03 ± 9,04 %; 23,17	9,02 ± 3,03 %; 12,25	F=2,79; p=0,11 (>0,05)
CD1a-CD83+	11,01 ± 4,04 %; 11,31	67,05 ± 6,02 %; 24,43	F=34,07; p=0,00001 (<0,05)
CD83+ CD86+	8,01 ± 2,02 %; 6,24	49,11 ± 5,03 %; 19,32	F=31,56; p=0,00001 (<0,05)
CD83+ CD80+	31,01 ± 12,02 %; 31,11	73,03 ± 4,02 %; 14,34	F=19,574 p=0,0003 (<0,05)
CCR7+	63,03 ± 14,1 %; 38,32	82,02 ± 6,01 %; 25,18	F=2,044 p=0,17 (>0,05)
HLA-DR+	91,01 ± 3,13 %; 8,26	92,02 ± 2,02 %; 9,02	F=0,16; p=0,68 (>0,05)

Примечание: M – среднее значение экспрессии иммунофенотипического маркера, m – ошибка среднего значения, δ – стандартное отклонение.

СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2013. № 3 (57)

Рис. 1. Микрофото. Иммунофенотип зрелых вакцинных ДК (CD1a-, CD83+, CD11c+, HLA DR+, CD86+), выращенных in vitro в присутствии ростового фактора GM-CSF (72 нг/мл), Фармсинтез (Россия) и IL-4 (45 нг/мл), CellGenix (Германия), нагруженных опухолевым лизатом и активированных TNF-α (20 нг/мл, BD (США), (световой микроскоп, ×100)

Рис. 2А. Зависимость экспрессии иммунофенотипических маркеров незрелых ДК от концентрации IL-4. Ось абсцисс – концентрации IL-4, нг/мл. Ось ординат – уровень экспрессии иммунофенотипических маркеров, %

Рис. 2Б. Отсутствие зависимости экспрессии иммунофенотипических маркеров незрелых ДК от концентрации IL-4. Ось абсцисс – концентрации IL-4, нг/мл.

Ось ординат – уровень экспрессии иммунофенотипических маркеров, % указанные сроки свидетельствует об их высокой функциональной активности.

Признаком функциональной активности ДК является повышение уровня экспрессии костиму-лирующих молекул CD80, CD86, молекул адгезии CD209, антигена CD83, характерного для терминальной степени созревания ДК по сравнению с незрелыми ДК.

На рис. 1 представлен иммунофенотип вакцинных ДК, изученный с помощью иммуноцитохимического метода. Маркеры активированных ДК (HLA DRhigh, CD1alow, CD80high, CD86high) экспрессируют 65–80 % клеток, что сопоставимо с результатами, полученными методом проточной цитофлуориметрии.

Для дифференцировки ДК из моноцитов периферической крови чаще используют GM-CSF в сочетании с IL-4 и их синергизм в индукции созревания [6, 10]. При этом используются различные концентрации IL-4 и GM-CSF без достаточно обоснованной аргументации, что свидетельствует о широком диапазоне их активности. На основе однофакторного регрессионного анализа нами проведена оценка влияния различных концентраций IL-4 на экспрессию иммунофеноти-пических маркеров незрелых и зрелых ДК. В результате были получены полиномиальные модели второго порядка: Yi=A0+A1×C+A2×C2 (1), где Yi – уровень экспрессии иммунофено-типического маркера (%), соответственно для Y1(CD1а+CD83-), Y2(CD1а+CD86+), Y3(CD1а+CD80+), Y4(CD1а+CD40+), Y5(CD1а+CD209+), Y6(HLA-DR+); A0, A1, A2 – численные значения коэффициентов моделей; С – концентрация IL-4, нг/мл. Коэффициенты детерминации моделей (R2) составили от 70,0 до 82,0. Это свидетельствует о возможности корректного применения выражения (1) для определения зависимости изменений соответствующей величины (Yi) от параметра (С).

На рис. 2А представлено наличие зависимостей экспрессии маркеров CD1а+CD83-; CD1а+CD40+ и CD1а+CD209+ от концентрации IL-4 от 0 до 45 нг/мл. На рис. 2Б демонстрируется отсутствие существенных изменений уровня экспрессии маркеров CD1а+CD86+; CD1а+CD80+ и HLA-DR+. Расчеты показывают, что оптимальный интервал концентрации IL-4 при дифференцировке ДК находится в пределах от 5 до 15 нг/мл. Дальнейшее увеличение этой концентрации не приводит к значимому повышению уровня экспрессии изучаемых маркеров.

Таким образом, незрелые и зрелые ДК, дифференцированные из моноцитов периферической крови в присутствии изученных концентраций GM-CSF и IL-4, обладают выраженной функциональной активностью, определяемой по экспрессии молекул активации, миграции и костимулирующих сигналов.

Выводы

Применение для созревания ДК ростового фактора ГМ-КСФ отечественного производства (Фармсинтез, Россия) обеспечивает получение результатов, сопоставимых с таковыми при использовании GM-CSF импортного производства (CellGenix, Германия).

Оптимальный интервал концентрации IL-4 для дифференцировки ДК находится в пределах от 5 до 15 нг/мл.

Для стандартизации технологического процесса получения вакцинных ДК рекомендуется исполь- зовать оптимальную панель моноклональных антител: CD14, CD1а, CD83, CD86, CD80, CCR7, HLA DR, метод проточной цитометрии или иммуноцитохимическое окрашивание.