Оптимизация единицы учета в гибридологическом анализе с целью получения новой информации о процессах рекомбинации

Материал и методы. Эксперименты представлены на томате и льне. Проведены контролируемые скрещивания и идентификация маркерных генотипов в расщепляющихся популяциях. Для томата использованы многомаркерные мутанты, контролирующие процессы оплодотворения, сингамии, мейоза, постмейоза, этапы формирования семян и др. Дополнительно проводились цитологические исследования образования хиазм в мейозе.

Нами изучены вопросы управления формообразовательным процессом при гибридизации: причины рекомбинационной изменчивости и методы ее оценки у высших растений на внутриорганном, органном, организменном и популяционном уровнях; роль особенностей архитектуры репродуктивных систем вида в рекомбинационных процессах во времени и пространстве; влияние секторного транспорта ассимилятов на формирование рекомбинантных гамет и зигот в отдельных пыльниках, цветках, плодах, соцветиях и т.д. в системе узнавания «свой или чужой» при искусственном регулировании репродуктивной нагрузки; зависимость синхронности репродуктивных и рекомбинационных процессов во времени и пространстве и их влияние на процессы формообразования; взаимосвязь уровня рекомбинации и степени селективной элиминации гамет и зигот в разных экзогенных условиях; зависимость частоты рекомбинации от величины гетерозиса и конкурентоспобности гибридов; влияние частоты кроссинговера на квазисцепление и их взаимосвязь и т.д. [1,2,3,4]. Это обусловлено многогранностью различных механизмов регулирования формообразовательного процесса у растения на разных этапах и стадиях селекционного процесса при комплексном рассмотрении проблемы «растение как система». Так, разница в высвобождении генотипической изменчивости в расщепляющихся популяциях имеет особое значение у высших организмов, которая может быть обусловлена коротким или сравнительно длительным жизненным циклом развития. Очевидно, что генетические системы, контролирующие выход генотипической изменчивости не должны быть селективно-нейтральны, выявлено влияние систем размножения на формирование потенциальной и свободной рекомбинационной изменчивости, например, самоопыляющимся видам высших растений, как правило, свойственна высокая частота хиазм и высвобождение относительно существенной генотипической изменчивости, наоборот, у перекрестноопыляющихся растений частота обменов на бивалент обычно ниже. а выход изменчивости, как правило, осуществляется регулярно из поколения в поколение, но малыми порциями [4], что объясняет один из механизмов у высших растений, обеспечивающий сбалансированную реализацию потенциала генотипической изменчивости в онтогенезе и филогенезе. в частности, в зависимости от системы размножения.

Для ряда объектов высших растений, таких как кукуруза, томат, конские бобы, рожь, горох, арабидопсис и др. установлена существенная возрастная динамика по частоте рекомбинаций [1,4,5], частота кроссинговера в маркированном сегменте может варьировать между отдельными цветками и соцветиями одного растения, причем с увеличением порядка расположения цветков и соцветий на стебле частота кроссинговера значимо уменьшается. Это может быть обусловлено возрастом, эволюционно сложившимися видовыми особенностями в характере распределения мейотических и постмейотических событий в пределах растения (между цветками и соцветиями) и даже отдельных репродуктивных структур (кисти, колоса и т.д.) в зависимости от постоянно меняющихся во времени и частично в пространстве экзогенных и эндогенных условий среды. Например, вариабельность значений частоты кроссинговера на первой и последующих соцветиях у томата можно объяснить не только различным влиянием факторов внешней среды на мейоз и постмейоз, но и особенностями онтогенетической «памяти» каждого соцветия и даже цветка, селективной элиминацией рекомбинантных гамет и зигот, селективной элиминацией рекомбинантов при осыпании определенных цветков и недоразвитых плодов, снижении элиминации рекомбинантов в стрессовых условиях за счет уменьшения конкуренции между репродуктивными органами за ограниченный питательный субстрат. Экспериментально это было показано при искусственном регулировании репродуктивной нагрузки в соцветиях и на растениях в целом [4]. Для быстроцветущих либо длительноцветущих высших растений в качестве механизма, обеспечивающего распределение защиты при реализации потенциала генотипической изменчивости в зависимости от изменения условий среды (экзогенной и эндогенной) в течение репродуктивного развития растений и связанные с продолжительностью стадий мейоза, постмейоза и селективной элиминации рекомбинантов [4].

У подавляющего большинства высших растений цветки расположены не одиночно, а образуют группировки с определенным пространственным расположением и последовательным порядком их инициации во времени. Большинство цветков в соцветиях (кисть, колос, головка, щиток, зонтик, завиток, извилина и т.д.) и соцветия на растениях, пыльца и семяпочки в бутонах закладываются друг за другом с небольшими временными интервалами при секторном транспорте ассимилятов в секции пыльников, к семяпочкам, цветкам, семенам, плодам, соцветиям и т.д., при определенном временном и пространственном прохождении стадий мейоза и оплодотворения в критические (незащищенные от стресса) периоды репродуктивного развития (4). Многие исследователи развитие каждого репродуктивного органа считают одним из неповторимых «репродуктивных эпизодов», определяющих генотипическую изменчивость в расщепляющихся популяциях. Система размножения растений может выступать в качестве своеобразных рецепторов действия факторов среды, экологическая «память» которых проявляется в усилении или ослаблении инбридинга либо ауткроссинга и пр., что в итоге может способствовать разному формированию рекомбинационной изменчивости за счет изменения частоты рекомбинаций и/или степени элиминации рекомбинантных гамет и зигот [2,4,7].

Правильный выбор единицы учета в гибридологическом анализе влияет на объективность информации о формировании расщепляющихся популяций на разных уровнях репродуктивного развития. Многочисленные исследования подтверждают концепцию внутренней (эндогенной) конкуренции за питательные вещества как основной фактор дифференциации за счет апикального доминирования и связанные с ним последующие процессы автономизации репродуктивных органов в пределах растения, соцветия или отдельного репродуктивного органа, генетический контроль развития репродуктивных структур и онтогенетическая нестабильность экспрессии генов, влияние на репродуктивную фазу цитоплазматической наследственности и явления гетерозиса во времени и пространстве, взаимосвязь рекомбинации и гетерозиса, взаимозависимость уровня частоты кроссинговера и квазисцепления, возрастная изменчивость избирательного оплодотворения и особенности селективной элиминации гамет и зигот в связи с архитектурой репродуктивной системы вида, селективная элиминация плодов и роль аттрагирующих центров, донорно-акцепторные взаимоотношения и секторный транспорт ассимилятов, действие искусственно регулируемой peпродуктивной нагрузки на развитие репродуктивных органов и структур и др. Все это указывает на совокупность эволюционно сложившихся механизмов обеспечивающих гибкость и пластичность репродуктивного аппарата покрытосеменных растений, способствующих специфично реагировать на изменяющиеся условия существования, а также распределяющих формирование рекомбинационной изменчивости во времени и пространстве, что в конечное итоге способствует более полному пониманию механизмов регулирования формообразовательного процесса у высших растений и высвобождению потенциальной генотипической изменчивости [4,7].

Динамичность формирования рекомбинационной изменчивости на внутриорганном (пыльники, определенные группы семяпочек, формирование семян в разных частях плода и др.) организменном уровне значительно усиливается совокупностью механизмов, определяющих высвобождение потенциальной генотипической изменчивости на уровне репродуктивного органа (органная изменчивость). Для многих высших растений, в частности, для примулы, кукурузы, гороха, томата, лука, сосны, арабидопсиса [1,2,4] и др. установлены существенные несоответствия в значениях частоты рекомбинаций в микро-и макроспорогенезе. Разыми авторами для разных объектов показано, что частота кроссинговера в микроспорогенезе иногда значимо выше, чем в макроспорогенезе. Половая детерминация частоты рекомбинаций может способствовать «равновесию сцепления и баланса» для различных локусов при наличии селективной элиминации гамет и зигот либо селективному давлению в пользу усиления сцепления генетических факторов, определяющих основные различия между полами. Имеются также экспериментальные данные органной рекомбинационной изменчивости в различных частях пыльников у ржи, тюльпана и томата [4,7]. В пыльнике цветков растений томата существует значимый градиент частоты хиазм от основания к свободному его концу: клетки, первыми вступившие в мейоз в основании пыльника, имеют наименьшую частоту хиазм, а клетки, вступившие в мейоз последними на свободном конце пыльника, характеризуются наибольшей частотой хиазм [1]. Практический интерес представляет согласованность последовательности мейотических делений и дифференциация поступления питательных веществ в секции пыльников с определенным распределением уровня частоты хиазм у таких относительно разных объектов как рожь и томат. Поэтому можно предположить, что органная изменчивость частоты рекомбинации в микро-и макроспорогенезе, а также разных секций пыльников может иметь адаптивное значение, приводя к различиям в уровне и спектре высвобождаемой генотипической изменчивости в последовательных группах потомства одних и тех же особей в пределах одного репродуктивного органа. При этом одним из главных механизмов формирования рекомбинационной изменчивости на органном уровне для большинства высших растений, вероятно, является селективная особенность на постмейотических этапах рекомбинантных гамет и зигот. У томата и кукурузы установлена селективная элиминация рекомбинантных гамет и зигот, чаще происходящая на этапах гаметогенеза, прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок, оплодотворения, развития зародыша, формирования и прорастание семян [1,4].

У подавляющего большинства видов цветковых растений предостаточно пыльцы, чтобы оплодотворить все семяпочки, как правило, пыцевых зерен значительно больше, чем семяпочек. Самоопыляемым видам относительно перекрестноопыляемых видов обычно свойственно меньшее соотношение пыльцевых зерен и семяпочек в одном цветке [3]. При этом генетическое разнообразие пыльцы может способствовать разной конкурентоспособности микрогамет (в основном за счет различий в скорости роста пыльцевых трубок в тканях пестика к семяпочкам), что в свою очередь, определит характер распределения генотипической и модификационной разнокачественности зигот и семян в пределах одного репродуктивного органа. Приспособленность всего растения и специфика метаболизма отдельного цветка существенно могут повлиять на направление и уровень давления внутреннего отбора, элиминацию рекомбинантных гамет и зигот, что связано с видовыми архитектурными особенностями репродуктивных систем [4,5,7].

Таким образом, связь рекомбинационной системы и системы размножения у высших растений, за счет эволюционно сложившейся совокупности механизмов, способствующих формированию рекомбинационной изменчивости на разных уровнях (популяционном, организменном, органном и внутриорганном), что в целом обеспечивает сбалансированную реализацию потенциала генотипической изменчивости. Адаптивность указанной связи проявляется в эволюционно обусловленной видовой специфике архитектуры репродуктивной системы в характере последовательного развития репродуктивных органов и структур на растении во времени и пространстве; количестве гамет, зигот и жизнеспособного потомства одного репродуктивного органа, соцветия и растения; особенностях системы размножения и продолжительности мейоза, постмейоза, оплодотворения , длительности роста зигот и всего жизненного цикла, и др. Сбалансированное действие совокупности эндогенных и экзогенных факторов на рекомбиногенез на разных уровнях проявляется в сравнительно регулярном образовании новых рекомбинантов как генетических вариантов в репродуктивном цикле, что способствует периодической проверке новых генных сочетаний и вытекает прикладной характер в разработке принципов и методов управления формообразовательным процессом на основе познания особенностей формирования рекомбинационной изменчивости у высших растений на разных уровнях: органном, организменном и популяционном [1].

Существует проблема выбора «единицы учета» в гибридологическом анализе, которая, возможно, тесно взаимосвязана с вопросом оценки достоверности установленного факта, то есть с определение вероятности того, насколько полученный результат случаен или закономерен. Например, возникает вопрос, каково должно быть оптимальное или минимальное количество особей в F2 для определена значимости отклонений расщеплений от теоретически ожидаемого соотношения 3:1, которое очевидно зависит от биологических особенностей архитектуры репродуктивной системы вида, сорта или формы (характера репродуктивного развития - продолжительности мейоза и/или численностей пыльцевых зерен и семяпочек в цветке потомства с одного плода, соцветия, растения и др.). Такая единица учета в лучшем случае должна соответствовать следующим критериям: рекомбинация в мейотических клетках гетерозиготы, а также процессы постмейоза должны проходить в относительно одинаковых условиях. Этот вопрос требует специального рассмотрения на основании специальных экспериментов и глубокой проработки имеющихся в литературе многочисленных экспериментальных данных для разных объектов с разными особенностями рекомбинационных и репродуктивных систем. С другой стороны, использование плода или другого структурного компонента репродуктивной системы как единицы оценки и отбора в селективной практике во многом обусловлено экспериментально установленными закономерностями распределения генетической изменчивости в пределах растения в зависимости от условий выращивания конкретной комбинации скрещивания и пока для многих культивируемых видов изучено недостаточно. При этом наши эксперименты и опубликованные экспериментальные данные разных авторов указывают, что у томата частота рекомбинаций в отдельных зонах генома находится в существенной зависимости от порядка заложения соцветия на главном стебле растения. Первое соцветие чаще характеризуется высокими значениями частоты кроссинговера относительно второго, третьего и последующих соцветий. Наблюдаемые различия по частоте рекомбинации могут способствовать разной степени селективной элиминации рекомбинантов между соцветиями и отдельными бутонами в пределах одного соцветия F1, обусловленные сложившимися под влиянием биотических и абиотических факторов условиями при прохождении репродуктивными органами соответствующих стадий развития - от закладки генеративных структур до семяобразования. При этом плод у растений гибридов F1 томата может выступать главной «ячейкой» в реализации потенциальной и доступной отбору генотипической изменчивости.

Известно, что рекомбинационная изменчивость и степень элиминации рекомбинантов на постмейотических этапах могут зависеть от гетерозиготности, гетерозисности и конкурентоспособности F 1 (по продуктивности), возраста гетерозиготного организма, условий его выращивания и др. При этом главная роль отводится изучению доступных и эффективных для широкого применения в селекционном процессе факторов, индуцирующих рекомбинационную изменчивость, таких как почвенная засуха, дефицит минерального питания, температура воздуха, загущение гибридов F 1 в условиях экологического стресса и др. Наряду с влиянием абиотических факторов важно вычленить роль генетических факторов в формировании рекомбинационной изменчивости на разных уровнях (популяционном, организменном и органном).

В рамках рассматриваемой проблемы особого внимания заслуживает гибридная гетерозиготность, выполняющая основную роль в высвобождении свободной и доступной генотипической изменчивости. В связи с этим возникает вопрос, - возрастает ли потенциал доступной селекционеру в F 2 генотипической изменчивости с ростом уровня гетерозиготности в F 1 , и как это связано с характером приспособленности гибридных комбинаций, репродуктивной нагрузкой, влиянием разной онтогенетической приспособленности генотипов по степени конкурентоспособности с учетом рекомбинационной изменчивости. При этом, как использовать конкуренцию в селекционном процессе в качестве рекомбинногенного фактора или фона отбора, либо тем и другим до сих пор недостаточно изучено, хотя работы в этом направлении ведутся довольно интенсивно [4].

Очевидно, что характер проявления разнообразия потомства в сильной степени зависит от стабилизирующего естественного отбора, который может существенно ограничивать искусственно генерируемую свободную изменчивость, элиминируя наиболее ценные генетические сочетания. Действие естественного отбора на всех этапах репродуктивного цикла гетерозиготного организма и постмейотические процессы, обусловлено множеством как эндогенных, так и экзогенных факторов. Нами изучен фактор «ограниченной» репродуктивной нагрузки» в условиях стресса, который отвечает требованиям системности, так как интегрировано может «затрагивать» все (и даже пока недоступные искусственному отбору) стадии постмейотической элиминации и, вероятно, важен в исследовании его влияния на характер селективной элиминации рекомбинанантных гамет и зигот. В этой связи, имеющиеся в литературе экспериментальные данные пока ориентированы на изучение воздействия искусственно ограниченной репродуктивной нагрузки на метаболизм, снижение конкуренции между репродуктивными органами за ограниченный питательный субстрат и пр., возделываемых высших растений, особенно, в стрессовых условиях [4]. Однако, наряду с широким применением физических и химических рекомбиногенных и мутагенных средств с целью увеличения генотипической изменчивости в расщепляющихся популяциях, такие мощные эволюционно сложившиеся видовые факторы, такие как конкуренция, гетерозис, архитектура репродуктивной системы вида, особенности репродуктивного развития во времени и пространстве и др., оказались недостаточно задействованными в разработке методов селеции.

Вып.45.- с.265-274.