Оптимизация метода исследования маммосферообразования для оценки IL-6 индуцированной стволовой пластичности дифференцированных клеток рака молочной железы

Метастазирование является одной из наиболее серьезных проблем в лечении рака. Согласно современным представлениям, способность дифференцированных опухолевых клеток к переходу в опухолевые стволовые клетки (ОСК), т.е. их стволовая пластичность или дедифференцировка, играет определяющую роль в инициации образования метастазов [1–3]. Изучение процесса дедифференцировки опухолевых клеток важно как при исследовании фундаментальных механизмов канцерогенеза, так и для оценки эффективности новых антиметастатических препаратов. Для подтверждения дедифференцировки, произошедшей под действием определенных факторов, in vitro используют такие методы, как оценка маммосферо-образования, определение уровня экспрессии генов и фенотипического профиля клеток с маркерами стволовых клеток.

Анализ образования маммосфер позволяет оценить количество и функциональную активность клеток, способных инициировать опухолевый рост [4]. Стандартный протокол анализа образования маммосфер включает в себя получение суспензии единичных клеток, рассадку на плашки со сверх- низким прикреплением и оценку образования сфероидов размером более 35–100 мкм через 5–14 дней в зависимости от клеточной линии и дизайна эксперимента [5–7]. Одним из основных вариабельных факторов при постановке экспериментов по оценке маммосферообразования является способ снятия клеток с поверхности флакона. В большинстве работ для снятия клеток с поверхности пластика используют растворы ферментов – трипсина, TrypLE или аккутазы [8, 9]. Однако существуют протоколы, предлагающие использование скребка для клеток (скрепера) в качестве альтернативы ферментам [10, 11]. Также остается неизученным вопрос о влиянии исходной конфлюентности клеток перед снятием с поверхности пластика на их способность образовывать маммосферы. Известно, что увеличение конфлюентности может приводить к изменению экспрессии маркеров на поверхности клетки, в том числе и маркеров стволовых клеток [12], что важно для определения субпопуляций клеток и сортинга дифференцированных опухолевых клеток. Влияние конфлюентности на экспрессию цитофлуориметрических маркеров стволовых клеток и маммосферообразование ранее изучены не были. Таким образом, для получения достоверных результатов важно оптимизировать метод мам-мосферообразования, а именно, оценить влияние конфлюентности и выбрать способ снятия клеток, позволяющий сохранить жизнеспособность и представленность рецепторов на мембране клеток. Это позволит минимизировать риск включения в анализ стволовых раковых клеток экспрессирующих CD44, но потерявших данный рецептор в процессе снятия с поверхности пластика.

Целью исследования явилась оптимизация метода оценки образования маммосфер после индуцированной интерлейкином 6 (IL6) стволовой пластичности у дифференцированных (CD44^–) опухолевых клеток линии рака молочной железы человека T47D.

Материал и методы

Эксперименты были выполнены на клетках линии T47D (люминальный рак молочной железы типа А), любезно предоставленной А.А. Нуштае-вой, ИБХФМ СО РАН, Новосибирск. Клетки (3–10 пассажа) культивировали в полной питательной среде RPMI-1640 (Gibco, США) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), глутамина (Gibco, США), гентамицина (Gibco, США), амфотерицина В (Синтез, Россия) (ППС RPMI-1640). Клетки с низкой (40–50 %) и высокой (70–80 %) конфлюентностью снимали с поверхности пластика 3 способами: с использованием TrypLE (Gibco, США), аккутазы (Stemcell Technologies, США) или скребка для клеток (Cell Scraper, Corning). Определение фенотипического профиля клеток проводили с использованием антител PE anti-human CD44 (клон BJ18, Sony Biotechnology, США) и APC anti-human CD24 (клон ML5, Sony Biotechnology, США) на проточном цитофлуориметре CytoFlex (Beckman Coulter, США), для исключения мертвых клеток из анализа проводили окрашивание 4’, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Thermo Fisher Scientific, США). Жизнеспособность клеток определяли с помощью набора AnnexinV:FITC Assay kit (Bio-Rad, Австрия).

Для оценки способности к образованию мам-мосфер 1 тыс. клеток в 1 мл среды Mammocult Basal Medium (Stemcell Technologies, США) с добавлением 10 % Mammocult proliferation supplement (Stemcell Technologies, США), 4 мкг/мл гепарина (Sigma, США), 0,48 мкг/мл гидрокортизона (Stemcell Technologies, США), антибиотика-антимикотика (Gibco, США) рассаживали в лунки 12-луночного планшета. Для уменьшения адгезии клеток к пластику дно лунок планшета предварительно покрывали 1 % агарозой (Хеликон, Россия). Для получения одноклеточной суспензии клетки предварительно пропускали через клеточное сито с размером пор 40 мкм (Corning). Планшеты инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 7 дней, после чего получали фотографии всех лунок с помощью сканирующего микроскопа Leica DMi8 (Leica,

Германия). Количество и диаметр маммосфер определяли, используя программное обеспечение ImageJ методом, предложенным Vlachou et al. [13] с модификациями.

Для изучения динамики дедифференцировки клеток под влиянием IL6 клетки линии T47D с конфлюентностью 70–80 % снимали с поверхности пластика с использованием аккутазы, окрашивали флуоресцентно-меченными антителами PE antihuman CD44 и APC anti-human CD24 и отбирали фракцию CD44– на клеточном сортере SH800 (Sony, США). Далее 50 тыс. клеток рассаживали в лунки 6-луночного планшета в 1 мл ППС RPMI-1640. Для индукции дедифференцировки в экспериментальные лунки добавляли 50 нг/мл IL6 (Abcam, США). Через 1, 3, 7 и 10 дней клетки снимали с поверхности лунок, проводили цитофлуориметрическую оценку экспрессии CD44 и CD24, а также изучали способность клеток образовывать маммосферы.

Статистическую обработку проводили с использованием пакета программ GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Сравнение количественных данных проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Для выявления достоверности различий в случае множественных сравнений использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA). Достоверность различий считали значимой при p˂0,05.

Результаты

Для оценки роли влияния исходной конфлюент-ности в монослое и выбора метода снятия клеток с пластика оценивали жизнеспособность, фенотипический профиль клеток и их способность образовывать маммосферы. Согласно полученным данным, использование TrypLE и аккутазы приводило к сопоставимым показателям жизнеспособности клеток (рис. 1). Можно отметить, что количество клеток с признаками раннего апоптоза (AnV+PI–) и позднего апоптоза (AnV+PI+) при использовании ферментативных методов снятия клеток (TrypLE и аккутазы) было выше при конфлюентности 40–50 % по сравнению с конфлюентностью 70–80 % (p˂0,05). При использовании TrypLE количество клеток с цитофлуориметрическими признаками апоптоза составило 27,47 ± 3,59 % при низкой конфлюентности и 16,64 ± 0,59 % при высокой конфлюентности, при использовании аккутазы – 24,72 ± 2,28 % и 18,98 ± 1,38 % соответственно.

Снятие клеток с использованием скребка приводило к существенному повышению количества клеток с цитофлуориметрическими признаками раннего и позднего апоптоза вне зависимости от исходного уровня конфлюентности. В случае низкой конфлюентности 63,58 ± 5,94 % клеток имели признаки апоптоза, в случае высокой конфлюент-ности – 62,67 ± 4,60 %. Дополнительным недостатком данного метода снятия клеток с пластика было отсутствие возможности получить одноклеточную суспензию, необходимую для корректной оценки образования маммосфер, ни тщательным пипети-рованием, ни продавливанием через иглу шприца G26, ни обработкой ДНКазой. В связи с этим в дальнейшем для оценки экспрессионного профиля клеток и способности образовывать маммосферы применяли клетки, снятые с поверхности пластика ферментативными методами.

Анализ профиля экспрессии поверхностных маркеров клеток показал, что при использовании аккутазы популяция представлена преимущественно CD44–CD24+клетками, 14,0 ± 0,33 % клеток имеют фенотип CD44+CD24+, а популяция стволовых клеток (CD44+CD24–/low) составляет 2,95 ± 0,21 %. При использовании TrypLE наблюдали уменьшение доли CD24+CD44+ клеток до 4,15 ± 0,28 % и

Рис. 1. Количество клеток линии T47D с цитофлуориметрическими признаками раннего апоптоза (AnV+PI–), некроза (AnV–PI+) и позднего апоптоза (AnV+PI+) при различных методах снятия с поверхности пластика: А – клетки с низкой конфлюентностью (40–50 %); Б – клетки с высокой конфлюентностью (70–80 %); В – репрезентативные гистограммы цитофлуориметрических признаков некроза, раннего и позднего апоптоза в исследуемых группах. Данные представлены как среднее ± SD, n=3.

Примечание: * – p˂0,05

Fig. 1. The effects of various cell-detaching methods on cell viability according to annexin V/PI staining protocol for flow cytometry: early apoptotic cells (AnV+PI), necrotic cells (AnV–PI+), late apoptotic cells (AnV+PI+). A – low confluence (40–50 %), Б – high confluence (70–80 %), B – representative flow cytometry histograms early apoptotic cells, necrotic cells, late apoptotic cells. Each data point presents mean ± SD from three experiments. Note: * – p-value˂0.05

3,42 ± 0,31 % при низкой и высокой конфлюент-ности соответственно (рис. 2), что может быть связано со слущиванием рецепторов CD44 и CD24 с поверхности под действием TrypLE.

Результаты оценки количества маммосфер, образуемых клетками при различной исходной конфлюентности и методах снятия с поверхности пластика (рис. 3), показали, что количество маммосфер и их средний диаметр не отличались между исследуемыми группами. Однако учитывая, что сохранение CD44 рецепторов на мембране необходимо для выделения популяции дифференцированных клеток методом флуоресцентноактивированной сортировки клеток (FACS) с использованием антител, для проведения дальнейших экспериментов клетки выращивали до

Конфлюентность, % /

Confluence, %

Рис. 2. Зависимость профиля клеток линии T47D от конфлюентности и метода снятия с поверхности пластика. Данные представлены как среднее ± SD, n=3. Примечание: * – p˂0,05 Fig. 2. The dependence of a phenotypic profile of T47D cells on various confluence and cell-detaching methods. Each data point presents the mean and standard deviation of three replicates.

Note: * – p-value˂0.05

_ Низкая конфлюентность/ _ Высокая конфлюентность / Low confluence               High confluence

Рис. 3. Маммосферообразование при различной конфлюентности клеток и способах снятия с поверхности пластика: А – количество маммосфер в исследуемых группах; Б – диаметр маммосфер в исследуемых группах.

Данные представлены как среднее ± SD, n=3. Примечание: * – p˂0,05 Fig. 3. The mammosphere formation under different cell confluence and celldetaching methods. A – the number of mammospheres, B – average mam-mosphere size. Each data point presents the mean and standard deviation of three replicates. Note: * – p-value˂0.05

Продолжительность инкубации с IL6, дни / Time of incubation with IL6, days

Б/B 10_                                      '

0123456789 10

Продолжительность инкубации c IL6, дни I Time of incubation with IL6, days

2 дня /

2 days

10 дней /

10 days

7 дней!

7 days

CD44" клетки после сортинга/

CD44" cells after sorting

Рис. 4. Влияние продолжительности инкубации после внесения IL6 на фенотипический профиль клеток: А – количество CD24+CD44+ клеток; Б – количество CD24–/lowCD44+ клеток; В – репрезентативные гистограммы изменения фенотипического профиля клеток линии T47D в течение 10 дней инкубации. Примечание: * – p˂0,05

Fig. 4. The effect of incubation time after IL-6 addition on phenotypic profile of the cells. A – the percentage of CD44+ CD24+ cells, B – the percentage of CD24–/lowCD44+ cells, C – representative flow cytometry histograms of T47D cells after IL6 exposure for 10 days. Each data point presents the mean and standard deviation of three replicates. Note: * – p-value˂0.05

Рис. 5. Влияние продолжительности инкубации после внесения IL6 на способность CD44–CD24+ клеток линии T47D к маммос-ферообразованию: А – количество маммосфер; Б – диаметр маммосфер; В – репрезентативные фотографии маммосфер после инкубации с IL6 в течение 1 сут. Данные представлены как среднее ± SD, n=3. Длина отрезка 20 мкм.

Примечание: * – p˂0,05

Fig. 5. The effect of incubation time after IL-6 addition on mammosphere formation by CD44–CD24+ cells. A – the number of mammo-spheres, B – average mammosphere size, C – Representative images of mammosphere formed by the cells after incubation with IL6 for 1 day. Each data point presents the mean and standard deviation of three replicates. Note: * – p-value˂0.05

70–80 % конфлюентности и снимали с использованием аккутазы.

Вторая часть эксперимента была направлена на изучение динамики изменения экспрессии поверхностных маркеров и способности к мам-мосферообразованию CD44–CD24+ клеток линии T47D (выделенных методом FACS) при инкубации с индуктором дедифференцировки IL6. Уже через 24 ч инкубации CD44–CD24+ клеток наблюдали появление CD44+ клеток (рис. 4). При стимуляции IL6 доля CD44+CD24+ клеток составила 40,52 ± ± 1,41 % и была выше, чем для клеток без стимуляции (32,44 ± 0,51 %) (p˂0,05). Популяция опухолевых стволовых клеток CD44+CD24–/low также возрастала по сравнению с исходной линией без сортировки (2,95 ± 0,21 %) и составила 7,76 ± 0,77 % при добавлении IL6 и 7,75 ± 0,69 % без добавления IL6. К 3-м сут доля CD44+CD24+клеток не изменялась как в опытных, так и в контрольных образцах, однако популяция CD44+CD24-/low снижалась по сравнению с 1-ми сут. К 7-м сут инкубации с IL6 процент CD44+CD24+ клеток резко снижался и к 10-м сут оставался ниже базального уровня экспрессии, характерного для линии T47D.

Анализ способности дифференцированных клеток образовывать маммосферы показал, что клетки после стимуляции IL6 в течение 24 ч образовывали в 3 раза больше маммосфер (рис. 5) по сравнению с контролем (дифференцированными клетками без добавления IL6). Увеличение продолжительности инкубации клеток с IL6 не влияло на их способность образовывать маммосферы (рис. 5А). В то же время при увеличении времени инкубации клеток в контроле (без добавления IL6) до 7 дней наблюдали тенденцию к увеличению количества образуемых маммосфер, что может быть связано со способностью клеток T47D вырабатывать эндогенный эстроген, который способен стимулировать пролиферацию ESR+ опухолевых клеток линии T47D. Интересно отметить, что CD44–CD24+клет-ки как при стимуляции IL6, так и без стимуляции образовывали меньше маммосфер, чем клетки исходной линии T47D, что можно объяснить отсутствием ОСК – CD44+CD24–. Продолжительность инкубации с IL6 не влияла на диаметр маммосфер (рис. 5Б).

Обсуждение

Полученные результаты об использовании аккутазы как оптимального реагента для снятия клеток линии T47D с поверхности пластика согласуются с данными Y. Quan et al. [14], полученными на линии клеток рака молочной железы MCF7. Важно отметить, что обработка TrypLE приводила к значительной потере CD44 рецепторов на поверхности клеток, тогда как количество CD24 рецепторов не изменялось. Это обусловлено тем, что в структуре CD44 содержится длинный трансмембранный домен, имеющий сайты протеолитического расщепления [15]. В то же время CD24 представляет собой сравнительно небольшой белок, закрепленный в мембране за счет гликозилфосфатидилинозитольного якоря. Известно, что TrypLE является трипсиноподобной протеазой и может воздействовать на сайты протеолитического расщепления CD44. Тогда как в составе аккутазы концентрация протеолитических ферментов ниже, так как их действие реализуется в комбинации с коллагенолитическими ферментами. Использование аккутазы позволяет получить одноклеточную суспензию, необходимую для оценки маммосфе-рообразования, и сохранить рецепторы на поверхности клетки для иммунной сортировки, поэтому является предпочтительным методом для выделения популяции дифференцированных клеток с целью дальнейшего исследования индукторов или блокаторов дедифференцировки.

Влияние цитокинов семейства интерлейкина 6 (преимущественно IL6 и онкостатина М) на дедифференцировку показано в широком спектре исследований. IL6 и онкостатин М способны индуцировать дедифференцировку с образованием ОСК или ОСК-подобных клеток посредством воздействия на сигнальные пути (STAT3, STAT1, ERK1/2, PI3K/AKT) и активации факторов транскрипции (Snail, Twist, Zeb1, Slug, Nrf2) [16]. Однако при проведении экспериментальных исследований ключевым остается вопрос о продолжительности инкубации с индуктором.

Согласно полученным данным, стимуляция дифференцированных (CD44–CD24+) клеток линии T47D IL6 уже через 24 ч приводит к появлению новых популяций CD44+CD24+ и CD44+CD24–/low, т.е. является достаточной для индукции дедифференцировки. Полученные данные хорошо согласуются