Оптимизация подходов к стандартизации фитопрепаратов на основе календулы лекарственной

Широкий спектр фармакологического действия цветков календулы ( Calendulae flores) обусловлен содержанием таких важнейших биологически активных соединений как каротиноиды, флавоноиды, сапонины и полисахариды [8]. Препараты цветков календулы лекарственной ( Calendula offi cinalis L.) обладают антимикробным, противовоспалительным, регенерирующим, отхаркивающим, желчегонным, противоязвенным, иммуномодулирующим свойствами. На наш взгляд, оптимальный подход к стандартизации любого вида лекарственного растительного сырья (ЛРС) должен включать в себя анализ на содержание ведущей группы биологически активных веществ (БАВ) [8]. В контексте цветков календулы это означает, что помимо контролирования сырья на содержание основных групп веществ – флавоноидов и сапонинов необходимо определять в растении нестабильные с точки зрения физикохимических свойств соединения – каротиноиды, которые можно назвать ведущей группой веществ. В цветках ноготков каротиноиды являются диагностичными и действующими компонентами [7]. В сырье календулы содержатся до 3 % различных каротиноидов: β -каротин, γ -каротин, δ -каротин, ликопин, неуроспорин, фитоен, фи-тофлуин, рубиксантин, ксантофил (лютеин), зеак-сантин, виолоксантин, флавохром, цитроксантин (мутатохром), флавоксантин, хризантемаксантин.

При этом наибольшую биологическую активность из них проявляет β -каротин [3, 10].

Наше представление о вкладе биологически активных веществ в суммарное терапевтическое действие растения, а также о важности каротиноидов подтверждается многочисленными публикациями исследователей относительно ключевой группы веществ данного растения – каротиноидов [4, 10, 12-14, 16, 18]. Учеными неоднократно изучалась корреляция между окраской цветков растения и содержанием каротиноидов, при этом рассматривались различные селекционные формы, а также отечественные и зарубежные сорта растения [1, 12, 13]. Обнаружено, например, что в рамках данной зависимости – содержания каротиноидов от окраски язычковых цветков – в сортах календулы с темно-оранжевыми цветками веществ почти в 10 раз больше, чем в желтых [12].

По литературным данным было также выявлено, что содержание каротиноидов в соцветиях также варьирует в зависимости от погодных условий и продолжительности фазы цветения. В процессе хранения содержание каротиноидов снижается по причине неустойчивости при воздействии влаги и света. Так, например, через 4 месяца после сбора цветков их становится приблизительно в 6 раз меньше, чем было в свежесобранном материале [5].

Однако, несмотря на пристальное внимание ученых к проблемам стандартизации сырья и фитопрепаратов на основе календулы, до сих пор наблюдается очевидная противоречивость и явная неточность в подходах к фармакогностическому исследованию растения [9, 10, 13, 15]. Само сырье – цветки ноготков в действующих стандартах качества (ГФ СССР XI издания, ВФС 42-1738-87 и Изменение № 2 от 20.05.1997 г.) стандартизируется по внешним и анатомо-диагностическим признакам, по содержанию влаги, золы, примесей, а также по количественному содержанию экстрактивных веществ, извлекаемых 70%-м этиловым спиртом [2].

Внимательное рассмотрение нормативных документов и фармакопей других стран позволяет увидеть те же аналитические проблемы. Обнаружено, что требования в Европейской и Британской фармакопеях к сырью полностью совпадают [12, 14]. Идентификацию воздушно-сухого сырья проводят по внешним признакам сырья, а также методом микроскопии с использованием раствора хлоралгидрата. Для качественного анализа используется тонкослойная хроматография (ТСХ) при 365 нм, с использованием ГСО рутина, что, на наш взгляд, является ошибочным подходом, так как по нашим данным в цветках данного растения доминирующим флавоноидом является нарциссин [9]. Для количественной характеристики используется содержание флавоноидов в пересчете на гиперозид (не менее 0,4%) [12, 14]. Данный флавоноид, как известно, не является специфическим веществом для цветков ноготков по данным отечественных ученых [9].

В отношении препаратов календулы («Настойка календулы») была разработана методика спектрофотометрического количественного определения суммы каротиноидов по β -каротину (ФС 42-1730-95) [12]. Определение проводится по собственному поглощению в видимой области спектра при 450 нм после предварительного разделения настойки на колонке с оксидом алюминия. Количественное содержание каротиноидов в настойке составило около 0,0017%, тогда как в исходном сырье – 0,5% [5].

Однако рассмотренные методики не в полной мере соответствуют современным представлениям о химической природе биологически активных соединений цветков календулы лекарственной.

Цель данной работы – совершенствование методики стандартизации суммы каротиноидов в цветках календулы лекарственной.

Материалы и методы: Объектом исследования служили цветки календулы лекарственной (сорт «Кальта»), собранные в Средне-Волжском филиале ФГБНУ ВИЛАР (урожай 2013-2015 г.), а также настойка календулы лекарственной (1:5), разработанная на базе кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии. В качестве образца сравнения использовалось облепиховое масло. В качестве метода исследования использовалась спектрофотометрия. Регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве растворителей для экстрагирования суммы каротиноидов из календулы лекарственной были использованы такие органические растворители, как гексан, хлороформ и ацетон. Были исследованы и определены такие параметры, как время экстрагирования, время экстракции и т.д. Определено, что оптимальными параметрами являются: экстрагент – гексан, соотношение сырье: экстрагент (1:30), время экстрагирования 2 часа при комнатной температуре, при периодическом перемешивании.

Результаты сравнительного исследования электронных спектров гексановых извлечений образцов цветков календулы лекарственной свидетельствуют о том, что для всех образцов сырья характерен максимум поглощения при λ _max =450±2 нм (рис. 1). В качестве удельного показателя поглощения Е^1% _1см β -каротина при длине волны 450 нм использовалось значение равное 2773 [11].

Интересно, что спектры поглощения гексанового извлечения цветков календулы и гексанового раствора облепихового масла имеют сходные

Рис. 1. Электронный спектр цветков календулы лекарственной

характеристики, что позволяет использовать данный препарат в качестве стандарта (рис. 2).

Результаты исследования показали, что содержание каротиноидов в цветках календулы сорт «Кальта», культивируемых в Средне-Волжском филиале ФГБНУ ВИЛАР (урожай 2013-2015 г.) варьирует от 33,50 мг% до 63,10 мг%, что свидетельствует о высоком качестве данного сырья и позволяет использовать для промышленного получения препаратов календулы.

Методика количественного определения содержания суммы каротиноидов в сырье календулы . Около 1 г сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл гексана, колбу закрывают пробкой и осуществляют экстракцию при периодическом перемешивании в течение 2 часов. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная полоса»). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 2 мл гексанового извлечения переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем гексаном до метки и перемешивают.

Оптическую плотность испытуемого раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют гексан.

Содержание суммы каротиноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье в мг% (X) вычисляют по формуле:

D x 30 x 25 x 1QQ x lQQQ •A.                                                      ,

2773 x m x 2 x (1QQ - W )

где D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – навеска сырья, г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, %;

2773 – удельный показатель поглощения Е^1% _1см P -каротина при длине волны 450 нм.

Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы каротиноидов в цветках календулы лекарственной представлены в таблице 1.

Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы каротиноидов в цветках календулы лекарственной с доверительной вероятностью 95% составляет ±3,57%.

В рамках оптимизации подходов к стандартизации сырья и препаратов на основе календулы лекарственной нами была рассмотрена возможность создания лекарственного средства «Календулы настойка». На наш взгляд, для существующего на сегодняшний день на фармацевтическом рынке лекарственного препарата «Настойка календулы» (1:10) применяется неоправданное разведение при промышленном получении лекарственной формы. В этой связи нами было предложено классическое соотношение (1:5) для

Рис. 2. Электронный спектр цветков календулы лекарственной и облепихового масла

Таблица 1. Метрологические характеристики методики количественного определения содержания суммы каротиноидов в цветках календулы лекарственной

/	X	S	P, %	t (P^f)	A X	E, %
10	63, 10	0,9686	95	2, 23	± 2, 16	± 3,57

Рис. 3. Электронный спектр настойки календулы (1:5)

настойки на основе цветков календулы. Настойка из данного вида ЛРС была получена методом модифицированной ремацерации. Кроме того, была изучена возможность анализа фитопрепарата на содержание каротиноидов.

Спектрофотометрический анализ проводили следующим образом. 5 мл настойки (1:5) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, трехкратно по 10, 10 и 5 мл производят извлечение каротиноидов гексаном в мерную колбу объемом 25 мл, доводят гексаном до метки. 2 мл гексанового извлечения количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем гексаном до метки и перемешивают.

Оптическую плотность испытуемого раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют гексан.

Содержание суммы каротиноидов в пересчете на p -каротин в мг% (X) вычисляют по формуле:

D х 25 х 25 х 1000

• X-                                ,

  2773 х Vх 2

где D – оптическая плотность испытуемого раствора;

• V – объем настойки, мл;

2773 – удельный показатель поглощения Е^1% _1см Р -каротина при длине волны 450 нм.

При анализе настойки был выявлен максимум поглощения, который не соответствует таковому для раствора гексанового извлечения цветков календулы лекарственной (рис. 3).

Видимо, это связано с тем обстоятельством, что при получении настойки календулы 70% этиловый спирт не позволяет исчерпывающе извлекать каротиноиды, в особенности р -каротин.

Вопрос относительно целесообразности стандартизации настойки календулы по содержанию суммы каротиноидов требует проведения дополнительных исследований, в том числе обоснования пробоподготовки гексанового извлечения из данного препарата.

ВЫВОДЫ

Обосновано целесообразность стандартизации цветков календулы не только по флавоноидам и сапонинам, но и по сумме каротиноидов.

Таким образом, в результате исследований была разработана методика определения содержания каротиноидов в цветках календулы для сорта «Кальта», культивируемого в Самарской области. Содержание суммы каротиноидов в цветках ноготков варьирует от 33,50 до 63,10 мг%±3,57%.

Предложенный подход по анализу сырья и препаратов на содержание ведущей и второй основной группы действующих веществ позволит объективно реализовать принцип гармонизации в ряду «лекарственное растительное сырье – лекарственный препарат».