Оптимизация процесса биодеструкции непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола

• ^a Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

• ^b Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

• ^c Пермская государственная фармацевтическая академия, 614990, Пермь, ул. Ленина, 48

• ^d Пермский государственный технический университет, 614990, Пермь, Комсомольский проспект, 29

На примере парацетамола подтверждена возможность использования актинобактерий рода Rhodococcus для биодеградации лекарственных средств, содержащих в своей структуре фенольную гидроксильную группу. Исследовано влияние вспомогательных веществ (крахмала, талька, стеариновой кислоты, поливинилпирролидона), входящих в состав таблеток парацетамола, на процесс его биоконверсии клетками родококков. Установлено, что поливинилпирролидон и стеариновая кислота используются бактериальными клетками в качестве дополнительных источников углерода и энергии. Показана возможность применения родококков, иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта, для интенсификации процесса биодеградации парацетамола. Выявлена зависимость константы скорости реакции биокаталитического окисления парацетамола от технологических параметров процесса - температуры инкубации родококков и скорости движения орбитального шейкера. Достигнуто соответствие результатов, полученных по теоретическому кинетическому уравнению, с экспериментальными данными. Полученное решение задачи оптимизации процесса биодеструкции парацетамола позволяет перейти к оценке характерных параметров процесса (температура и окружная скорость движения жидкости в лабораторной установке) и организации управления технологическим процессом в полупромышленных условиях.

В последние годы в России четко обозначилась проблема утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств – фальсифицированных, бракованных, с истекшим сроком годности и утративших потребительские качества из-за неправильного хранения или транспортировки. Все непригодные к медицинскому использованию лекарственные средства относятся к опасным отходам и подлежат обязательному уничтожению (Приказ МЗ РФ N. 382 от 15.12.2002). Однако рекомендуемые методы их уничтожения (слив в промышленную канализацию, сжигание и захоронение на свалках) не являются экологически безопасными. Сегодня приоритет по показателям эффективности, безопасности и экономичности признается за биотехнологическими способами утилизации опасных отходов.

Основу многих лекарств составляют органические соединения, содержащие в молекуле фенольную гидроксильную группу. Для прямого окисления данных органических субстратов перспективно использование           микроорганизмов, обладающих активностью оксигеназ, в частности актинобактерий рода Rhodococcus.

В Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН создана наиболее полная в России и за рубежом коллекция чистых идентифицированных непатогенных культур родококков (Ivshina,

• 2001). В ранних работах авторов (Ившина и

  др., 1995, 2006) показана возможность использования актинобактерий рода Rhodococcus для биодеградации лекарственных средств, содержащих фенольную гидроксильную группу, на

примере парацетамола.

Цель настоящего исследования – оптимизация и теоретическая оценка

основных параметров процесса биодеградации парацетамола с использованием актинобактерий рода Rhodococcus .

Материалы и методы

В работе использовали парацетамол в виде фармацевтической субстанции производства Ирбитского ХФЗ и таблеток (ЗАО «Медисорб», г. Пермь), содержащих 0,2 г парацетамола и 10% вспомогательных веществ (крахмал, тальк, поливинилпирроли-дон и стеариновая кислота). В качестве биодеструктора использовали штамм R. erythropolis ИЭГМ 767 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, .

Посевным материалом служила 3-суточная культура в концентрации 10⁷ клеток/мл, предварительно выращенная в присутствии фенола с целью индукции оксигеназ. Иммобилизацию осуществляли путем внесения бактериальной взвеси в раствор поливинилового спирта в соотношении 1:2. Биодеградацию парацетамола проводили в минеральной среде «Rhodococcus surfactant» (Ившина и др., 2006) при 28 и 35⁰ С с использованием орбитального шейкера (160 и 200 об/мин).

Содержание парацетамола определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью хроматографа модели HP-1090 (США) с использованием колонки ZORBAX Extend-C18 (4,6х250 мм). Качественный состав продуктов биотрансформации анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол» (Sigma-Aldrich, США). Содержание первичного метаболита п-аминофенола определяли с помощью спектрофотометра типа Lambda EZ201 (Perkin-Elmer, США) при длине волны 450 нм. Учет бактериальных клеток проводили методом точечных высевов на чашки Петри (Веслополова, 1995). Исследования проводили в 3-8-кратных повторностях. Обработку полученных данных осуществляли с помощью компьютерных программ Excel, Statistica 6.0.

Результаты и обсуждения

Как видно из рис. 1, полная биодеградация парацетамола в виде фармацевтической субстанции составляет 72 ч, в виде целых таблеток - 24 ч. Разница в продолжительности процесса биодеструкции парацетамола в зависимости от используемых лекарственных форм, вероятно, объясняется присутствием в составе таблеток парацетамола вспомогательных веществ: поливинилпир-ролидона (ПВП), талька, стеариновой кислоты и крахмала. Ростовые эксперименты по использованию вспомогательных веществ в качестве единственного источника углерода показали, что наиболее активно используются родококками ПВП и стеариновая кислота (таблица).

Рис. 1. Динамика убыли парацетамола (1, 2) и п -аминофенола (3, 4) в виде фармацевтической субстанции (1, 3) и таблеток (2, 4) в процессе биодеградации

Таблица 1

Динамика численности клеток R. erythropolis ИЭГМ 767 в присутствии вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток парацетамола

Время, сут	Вспомогательное вещество	Количество клеток/мл
	Стеариновая кислота	(2,70±0,17) х 107
0	Крахмал Тальк	(4,37±0,20)х 107 (2,54±0,19)х 107
	ПВП	(3,61±0,32)х 107
	Стеариновая кислота	(3,86±0,19)х 109
5	Крахмал Тальк	(1,38±0,11)х 108 (2,49±0,08)х 108
	ПВП	(2,23±0,15)х 109
	Стеариновая кислота	(4,27±0,02)х 1010
7	Крахмал Тальк	(1,20±0,11)х 108 (1,45±0,12)х 108
	ПВП	(2,46±0,16)х 1010

По нашим данным, содержание п -аминофенола достигает максимального значения на 12-14-й ч эксперимента, а затем количество его снижается. Другие метаболиты (пирокатехин, гидрохинон, бензохинон) регистрируются на 1-3-и сут эксперимента.

Как видно из рис. 2, использование иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков, предварительно адаптированных к фенолу, позволяет существенно сократить продолжительность процесса биодеструкции парацетамола до 14 и 24 ч в случае использования его в виде субстанции и таблеток соответственно. Следует отметить, что процесс биодеструкции парацетамола в виде таблеток при использовании иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта клеток родококков происходит значительно медленнее (24 ч) по сравнению с процессом биодеструкции парацетамола в виде субстанции (14 ч). Данный факт можно объяснить взаимодействием поливинилового спирта с ПВП. Химическое взаимодействие носителя и вспомогательного вещества таблеток замедляет процесс. При этом максимальное содержание п-аминофенола при биодеструкции парацетамола в виде субстанции иммобилизованными клетками регистрируется через 12 ч, а при использовании парацетамола в виде таблеток через 22 ч.

Рис. 2. Динамика убыли парацетамола (1, 2) и п-аминофенола (3, 4) в процессе биодеградации в виде фармацевтической субстанции (1, 3) и таблеток (2, 4) клетками R. erythropolis ИЭГМ 767, иммобилизованными в криогеле поливинилового спирта.

Рис. 3. Зависимость константы скорости реакции k 1 биокаталитического окисления парацетамола клетками родококков от орбитальной скорости вращения шейкера и температуры среды инкубации родококков

На основании полученных данных по изменению содержания парацетамола во времени разработана кинетическая схема процесса биодеструкции парацетамола. Предложены кинетические уравнения dx dt dx dt

- k 1 x , (1)

- k₂x = - k    " , (2)

У x0 — x где х0, х – начальная и текущая концентрации парацетамола; у = х0 – х – концентрация п-аминофенола; k1, k2 – константы скорости реакции (определены экспериментально).

Для определения технологических параметров, необходимых для перехода к процессу биодеструкции парацетамола в полупромышленных условиях, использовали кинетическое уравнение (1), поскольку оно оказалось более удобным для применения в лабораторной практике. По нашим данным, наибольшее влияние на скорость и полноту биодеструкции парацетамола оказывают температура инкубации родококков и скорость орбитального вращения в шейкере. Ввиду того, что параметров оптимизации всего два, целесообразно было найти оптимальное решение графически (рис. 3). Коэффициент k1 имеет явную тенденцию к увеличению по мере повышения температуры и скорости перемешивания. Максимальное значение k1 (k1 max = 1,233 сут-1) находится на границе допустимой области по температуре (Т = 35оС) и имеет тенденцию роста при этой температуре в сторону увеличения скорости перемешивания (n = 200 об/мин).Теоретические данные полностью совпадают с данными, полученными экспериментальным путем. Достигнутое решение задачи оптимизации процесса биодеструкции парацетамола позволяет перейти к оценке характерных параметров процесса (температура и окружная скорость движения жидкости в лабораторной установке) и организации управления технологическим процессом в полупромышленных условиях.

Заключение

Установлено, что присутствие стеариновой кислоты и поливинилпирролидона, входящих в состав таблеток парацетамола в качестве вспомогательных веществ, ускоряет процесс биодеградации парацетамола свободными клетками родококков. Выявлена зависимость константы скорости реакции биокаталитического окисления парацетамола от технологических параметров процесса: температуры инкубации родококков и орбитальной скорости движения шейкера. Получено решение задачи оптимизации процесса биодеструкции парацетамола в лабораторных условиях. Определены начальные значения технологических параметров (температуры и угловой скорости вращения мешалки ферментера) для проведения процесса в полупромышленных условиях.

Исследования поддержаны грантами Президента РФ "Ведущие научные школы" № НШ-4112.2008.4, Президиума РАН «Биологическое разнообразие» и РФФИ № 07-04-96038-р _ Урал_а.