Оптимизация протокола интрамиокардиальной трансплантации с использованием люминесценции кардиальных мезенхимальных клеток, маркированных экспрессией люциферазы

Оценка активности люциферазы в белковых лизатах клеток

Активность люциферазы определяли в белковых лизатах трех типов: КМК-Luc, культивировавшихся in vitro; КМК-Luc, культивировавшихся in vitro, заключенных в фибриновый сгусток; в белковом экстракте миокарда, изолированного через 60 мин после трансплантации КМК-Luc. Регистрировали люминесценции на приборе Wallac 1420 Multilabel Counter Victor-3 с использованием набора Luciferase Assay Reporter System (Promega). Получали клеточный лизат и проводили детекцию активности люциферазы в клетках согласно рекомендациям Promega с небольшими модификациями. После добавления лизирующего буфера (25 мМ Трис pH 7,8; 2 мМ ЭДТА; 2 мМ ДТТ; 10% глицерола; 1% Тритон Х-100) клетки разрушали методом замораживания в жидком азоте и размораживания на водяной бане при температуре 37 °С. Ткань миокарда в небольшом количестве азота измельчали в пудру и лизировали в равном объеме двукратного лизирующего буфера с добавлением ингибиторов протеаз Complete Mini, EDTA Free (Roche) в течение 15 мин; замораживали, размораживали, центрифугировали при 10 000 g 5 мин и собирали супернатант [5]. К осадку добавляли 0,5 мл двукратного лизирующего буфера, процедуру лизиса клеток повторяли. Второй супернатант смешивали с первым и хранили при температуре –70 °С до определения активности люциферазы.

Плазму крови для формирования фибринового сгустка получали из цельной крови крыс (с добавлением 0,2% цитрата натрия) методом последовательного центрифугирования при 400 и 1 000 g. Сгусток формировался при добавлении к плазме крови равного объема среды DMEM в течение 2–4 мин [6]. Подобранное время позволяет проводить инъекции клеток и плазмы так, чтобы фибриновый сгусток с целевыми клетками формировался непосредственно в миокарде.

Трансплантация люминесценции культуры кардиальных мезенхимальных клеток в миокард крыс линии WAG

Проводили эксперименты на лабораторных животных в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755 и приложение к приказу МЗ СССР № 565 от 04.10.1977) и принципами Хельсинкской декларации, разработанной Всемирной медицинской ассоциацией (2000). Животные содержались на стандартной диете и имели свободный доступ к воде. Эксперимент выполняли на 5–6-месячных крысах-самцах линии WAG массой 250–300 г. Крыс наркотизировали смесью золетила (130 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг) интраперитонеально, за 15 мин до наркоза проводили премедикацию сульфатом атропина (0,1 мг/кг) подкожно. Крыс интубировали, проводили искусственную вентиляцию легких кислородом при помощи аппарата Harvard Apparatus 683 Rodent Ventilator. Доступ в грудную клетку осуществляли латерально слева между IV и V ребрами. Инфаркт миокарда моделировался постоянной окклюзией передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на 1–2 мм ниже выхода артерии из-под ушка левого предсердия атравматичной иглой размером 6-0 и кривизной 3/8 круга [4]. Инфаркт диагностировали по показателям электрокардиограммы (поднятие зубца ST) и бледности миокарда ниже места окклюзии. Вводили клетки инсулиновым шприцем со встроенной иглой 30G BD Microfine. Иглу ограничивали фиксатором, сделанным из носика для автоматической пипетки, и загибали под углом 45° для удобства и стандартизации процедуры трансплантации. Трансплантировали

Количество лизированных клеток в 10 мкл

Рис. 1. Зависимость люминесценции лизата КМК-Luc в фибриновом геле и суспензии DMEM от количества клеток в образце

КМК-Luc 20 крысам, разделенным на 4 группы. Первой и второй группам (инфаркт миокарда и ложная операция) вводили суспензию 106 клеток в культуральной среде DMEM объемом 100 мкл, третьей и четвертой группам (инфаркт миокарда и ложная операция) – смесь 50 мкл среды DMEM с 106 клеток и 50 мкл плазмы крови. Отметили клетки дополнительно митохондриальным красителем MitoTracker Deep Red FM (abs/em ~644/665 nm) для последующей визуализации зоны трансплантации. Крыс выводили из эксперимента инъекцией 1 мл KСl 7,5% в сердце. На приборе Kodak In-Vivo Imaging System выделяли зону миокарда с введенными клетками. Образцы ткани быстро замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –70 °С до момента проведения последующего анализа. Для каждого опыта отбирали и хранили при температуре –70 °С контрольную аликвоту КМК-Luc для определения и расчета люминесценции клеток. Аликвота – известное количество клеток в среде DMEM или фибриновом геле в зависимости от условий эксперимента на животном.

Для каждого опыта рассчитывали значение люминесценции одной клетки в контроле и по значению люминесценции опытного образца определяли абсолютное количество клеток, которое нормировалось в ответ на количество введенных клеток.

Определение биолюминесценции живых клеток

Оценку биолюминесценции КМК-Luc проводили на приборе Kodak In-Vivo Imaging System. Суспензию клеток в культуральной среде помещали в лунку 96-ячеечного планшета (S = 0,32 см2). Регистрировали излучения сразу после добавления к клеткам люциферина (d-luciferin 0,15 мг/мл) [7].

Согласно рекомендациям производителя, пометили клетки митохондриальным красителем MitoTracker Deep Red FM для сопоставления данных люминесценции и флуоресценции красителя.

После определения биолюминесценции in vivo из клеток приготовили белковый экстракт для определения активности люциферазы на приборе Wallac Multilabel Counter Victor-3 по вышеописанному протоколу.

Определение биолюминесценции in vivo клеток, трансплантированных в скелетную мышцу мышей линии SCID

Трансплантировали клетки КМК-Luc, дополнительно помеченные MitoTracker Deep Red FM, в мышцы тазовой конечности мышей линии SCID. Вводили клетки в состав фибринового геля, служащего для них матриксом. Вводимая смесь состояла из 50 мкл плазмы крови

Рис. 2. Процент обнаруживаемых КМК-Luc от введенного количества в зависимости от состава введенной смеси и условий операции. ПНВ – передняя нисходящая ветвь левой коронарной артерии. * р ≤ 0,05; t-test

и 50 мкл суспензии 106 клеток КМК-Luc в культуральной среде. На 5-е сутки наркотизировали мышей смесью золетила (130 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг) внутримышечно, в хвостовую вену вводили раствор люциферина 30 мг/кг [7, 8]. Фиксировали биолюминесценцию на приборе Kodak In-Vivo Imaging System.

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета Statistica 6.0. Для выявления различий между группами использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента. Различия между группами считали достоверными при p<0,05. Данные представляли в виде среднее значение ± ошибка среднего.

Результаты и обсуждение

Оценка люминесценции в белковом экстракте культуры клеток

После трансдукции конструкции pLenti PGK V5-Luc Neo в составе лентивирусных частиц в КМК для получения однородной культуры, экспрессирующей ген люциферазы, клетки инкубировали в присутствии антибиотика G418 в течение недели. В белковых экстрактах клеток культуры КМК-Luc определяли активность люциферазы и строили калибровочные прямые. Показана линейная зависимость между количеством лизированных клеток и регистрируемым свечением, которая воспроизводится на разных пассажах КМК-Luc. Таким образом, культура КМК-Luc однородна, и каждая клетка экспрессирует ген люциферазы. Поскольку мы планировали проводить трансплантацию КМК-Luс в миокард крыс в составе фибринового матрикса, необходимо было оценить его влияние на метод детекции люциферазы. При проведении одновременной детекции люциферазы в лизатах КМК-Luc в фибриновом матриксе и клеток в суспензии мы обнаружили, что значения регистрируемого свечения отличаются в среднем в 1,5 раза. Мы предположили, что это связано с влиянием фибринового матрикса на лизис клеток и/или диффузию фермента из матрикса (рис. 1).

Определение люминесценции в белковом экстракте миокарда крысы после трансплантации люминесценции культуры кардиальных мезенхимальных клеток

Для оценки качества трансплантации клеток в миокард провели эксперимент по выявлению люминесценции в белковом экстракте, полученном из клеток

Рис. 3. Зависимость люминесценции живых клеток (левая ось) и люминесценции белкового экстракта клеток (правая ось) от количества КМК-Luc

миокарда крысы после трансплантации КМК-Luc. Ранее мы наблюдали присутствие трансплантированных КМК, меченных MitoTracker Deep Red FM в изолированном сердце крысы [4]. Однако данный краситель сохраняется в тканях после гибели трансплантированных клеток и не позволяет судить о количестве выживших клеток. Активность люциферазы выявляется исключительно в живых клетках, так как этот фермент взаимодействует со своим субстратом d-люциферином только в присутствии аденозинтрифосфата. Также в случае естественной гибели клетки фермент деградирует, поэтому использование КМК, меченных люциферазой, позволяет оценить количество жизнеспособных клеток после трансплантации. В первую очередь необходимо было разработать методику количественного определения клеток КМК-Luc в миокарде и оценить ошибку метода при определении активности люциферазы в экстрактах клеток миокарда. В миокард крыс сделали инъекции клеток КМК-Luc в суспензии (5 образцов) и фибриновом матриксе (5 образцов). Сразу после инъекции из образцов выделяли белковые экстракты, в которых определяли активность люциферазы (нулевая точка). В контрольных образцах определяли активность люциферазы в пересчете на одну клетку и рассчитывали ожидаемое значение активности для введенных в опыте клеток. Отношение наблюдаемого значения активности фермента к ожидаемому значению являлось показателем чувствительности метода. В белковых экстрактах миокарда обеих групп в нулевой точке мы зарегистрировали активность люциферазы, соответствующую активности в 43,50±4,45% введенных клеток. Таким образом, при определении активности люциферазы в белковых экстрактах ткани миокарда максимальное значение, определяемое в опытных образцах, соответствует в среднем 43% теоретического значения, рассчитанного на основании контрольных аликвот клеток.

Для определения эффективности процедуры трансплантации клеток в ишемизированный и неишемизированный миокард мы определяли активность люциферазы в экстрактах ткани миокарда через 60 мин после введения КМК-Luc. Клетки инъецированы в количестве 106 в 100 мкл среды DMEM (5 крыс с инфарктом миокарда, 5 крыс с ложной операцией) и в 100 мкл смеси DMEM/плазма крови (1:1) (5 крыс с инфарктом миокарда, 5 крыс с ложной операцией).

Рис. 4. Зависимость интенсивности флуоресценции MitoTracker Deep Red FM и биолюминесценции люциферина от количества КМК-Luc в образце. Трансплантация КМК-Luc в мышцы тазовой конечности и холку мыши линии SCID. Визуализация флуоресценции (слева) и биолюминесценции (справа) клеток КМК-Luc, меченных MitoTracker Deep Red FM

В неишемизированном миокарде группы ложно оперированных крыс через 60 мин после трансплантации исследуемых клеток обнаружили 42,52±4,38% КМК-Luc, введенных в фибриновом матриксе, и 28,48±4,42% КМК-Luc, введенных в культуральной среде. В ишемизированном миокарде через 60 мин после окклюзии передней нисходящей ветви левой коронарной артерии и трансплантации клеток в периинфарктную зону выявили 42,9±4,63% КМК-Luc, введенных в фибриновом матриксе, и 38,31±4,16% КМК-Luc, введенных в культуральной среде (рис. 2). Предположительно, различие между количеством клеток, обнаруженных через 60 мин после введения в ишемизированный и интактный миокард без применения фибринового геля, можно объяснить тем, что окклюзия одной из коронарных артерий значительно снизила объемную перфузию зоны, в которую вводили клетки, тем самым способствовала уменьшению количества клеток, вымываемых в системный кровоток. Фибриновый гель, вероятно, влиял на задержание клеток в месте инъекции.

Таким образом, при трансплантации суспензии КМК-Luc в культуральной среде в неишемизированный миокард у ложно оперированных крыс через 60 мин заре- гистрировали достоверно меньшее количество клеток по сравнению с количеством клеток, трансплантированных в фибриновом матриксе. При трансплантации клеток в периинфарктную зону после ишемического поражения миокарда в обеих группах обнаружили высокую степень задержки КМК-Luc в ткани сердца. В дальнейшем полученные данные можно использовать для оптимизации протоколов трансплантации клеток в организм реципиента.

Определение биолюминесценции клеток in vitro

Люминесценцию живых клеток КМК-Luc in vitro регистрировали на приборе In-Vivo Imaging System сразу после добавления в культуральную среду люциферина в концентрации 15 мг/мл. Сигнал наблюдали при плотности КМК-Luc не менее 3 000 кл/см² (10³ клеток и более чем в одной лунке 96-ячеечного культурального планшета). После завершения измерения определяли активность люциферазы биохимическим методом в лизатах клеток (рис. 3).

Дополнительно клетки пометили митохондриальным красителем MitoTracker Deep Red FM, конъюгиро- ванным с флуорохромом для сравнения преимуществ визуализации целевых клеток. На рис. 3 и 4 видно, что интенсивность флуоресценции клеток, меченных с помощью митохондриального красителя, так же как и биолюминесценции модифицированных клеток, прямо пропорциональна их количеству, и в диапазоне от 104 до 105 клеток эту зависимость можно считать линейной. Недостатком биолюминесценции является ограниченный период свечения. После добавления к клеткам субстрата d-люциферина свечение регистрировали не более 15 мин, в то время как клетки, меченные MitoTracker Deep Red FM, флуоресцировали продолжительное время. Однако, как было сказано выше, этот краситель не позволяет определить жизнеспособность клеток.

Визуализация клеток, трансплантированных в скелетную мышцу мышей линииSСID, методом биолюминесценции

Для тестирования метода прижизненной визуализации трансплантированных клеток в тканях животных провели инъекции клеток КМК-Luc в составе фибринового геля в мышцы тазовой конечности мышей линии SСID. Клетки дополнительно пометили MitoTracker Deep Red FM для удобства их обнаружения в тканях мыши. Визуализацию проводили на приборе Kodak In Vivo Imaging System в наркотизированных мышах, которым системно ввели препарат люциферина. Флюоресценцию и биолюминесценцию трансплантированных клеток в области тазовой конечности наблюдали на 5-е сутки после инъекции (рис. 4). Совпадение областей флуоресцентного и люминесцентного сигналов подтверждает, что введенные клетки сохраняют жизнеспособность, а наш метод подходит для прижизненной регистрации и отслеживания динамики введенных клеток.

Выводы

• 1.    При использовании вышеперечисленных методов регистрации люминесценции в белковых экстрактах КМК-Luc степень излучения находилась в прямой зависимости от количества клеток.

• 2.    Фибриновый гель – оптимальный матрикс для фиксации клеток в образце с целью определения интенсивности люминесценции исследуемой культуры.

• 3.    Степень приживаемости клеток в миокарде следует оценивать исходя из интенсивности люминесценции, наблюдаемой после имплантации клеток в миокард в нулевой момент времени.

• 4.    Перфузия миокарда влияет на эффективность трансплантации суспензии КМК-Luc в культуральной среде в неишимизированный миокард (28,48±4,42% клеток). При трансплантации КМК-Luc в фибриновом матриксе в неишимизированный миокард выявили 42,52±4,38% клеток.

• 5.    При трансплантации клеток в периинфарктную зону после ишемического поражения миокарда в обеих группах обнаружили высокую степень задержки КМК-Luc в ткани сердца (42,9±4,63% КМК-Luc в фибриновом матриксе и 38,31±4,16% КМК-Luc в суспензии).

Полученные данные можно использовать для оптимизации протоколов трансплантации клеток в организм реципиента.

Работа поддержана программой «Молекулярная клеточная биология» (проект № 6.15).